導(dǎo)言

成熟T細(xì)胞通過(guò)TCR識(shí)別并與抗原-MHC復(fù)合物反應(yīng)。TCR活化的最直接后果是信號(hào)通路的起始，這些信號(hào)通路包括誘導(dǎo)特異性蛋白酪氨酸激酶（PTKs）、PIP2分解、PKC活化以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高。這些早期事件被傳遞到核，產(chǎn)生諸多效應(yīng)：

1、 T細(xì)胞克隆的擴(kuò)增

2、 細(xì)胞表面活化標(biāo)志的上調(diào)

3、 分化成效應(yīng)性細(xì)胞

4、 誘導(dǎo)細(xì)胞毒或細(xì)胞因子的分泌

5、 誘導(dǎo)凋亡

最常用的體外刺激檢測(cè) T細(xì)胞增殖的方法是用 TCR的抗原或競(jìng)爭(zhēng)性抗體活化 T細(xì)胞。

本 protocol 是一個(gè)基本方法，用 CD3 體外刺激小鼠脾 T 細(xì)胞和人類外周血 T細(xì)胞的增殖，關(guān)鍵參數(shù)包括細(xì)胞密度、抗體滴度和活化動(dòng)力學(xué)。

一、 小鼠：

用包被的 145-2C11單抗刺激小鼠T細(xì)胞；MTT法測(cè)細(xì)胞增殖

材料

1X 無(wú)菌 PBS

Anti-mouse CD3e, Clone 145-2C11 (Functional Grade, eBioscience Cat. No. 16-0031, or Purified,eBioscience Cat. No. 14-0031)

RPMI-1640 完全培養(yǎng)基

無(wú)菌的小鼠脾臟或淋巴結(jié)單細(xì)胞懸液

96 孔平底帶蓋微孔板

MTT Buffer

MTT裂解液

刀豆蛋白 A，可選 (ConA, Sigma Cat. No. C5275)

儀器用具

微量移液器或排槍

離心機(jī)

37°C, CO2培養(yǎng)箱

96孔板讀板機(jī)

實(shí)驗(yàn)時(shí)間

2小時(shí)包被抗體

20分鐘制備脾臟單細(xì)胞懸液

20分鐘分析設(shè)置

2-4天孵育

實(shí)驗(yàn)步驟

抗體包被至微孔板：

1、 用無(wú)菌 PBS 制備 5-10µg/ml 的 anti-CD3e (145-2C11)抗體溶液，計(jì)算所需的抗體量，每個(gè)條件或樣品做復(fù)孔。例如，包被半張板需要 2.6ml 抗體溶液。若用其他抗體共刺激時(shí)，CD3 抗體的濃度可以降低。

2、 每孔加入 50μl 抗體，空白對(duì)照孔加 50μl 無(wú)菌 PBS。

3、 用ParafilmTM膜將板封好，37℃孵育 2 小時(shí)或 4℃過(guò)夜。

4、 加細(xì)胞之前，將孔內(nèi)的抗體溶液吸去。

5、 每孔用 200μl 無(wú)菌 PBS 洗后，棄去 PBS。

6、 重復(fù)洗一次，去除所有的未結(jié)合抗體。

加細(xì)胞：

1、 取脾臟，無(wú)菌制備單細(xì)胞懸液。溶血去除紅細(xì)胞。

2、 計(jì)數(shù)細(xì)胞并重懸于RPMI-1640 完全培養(yǎng)基中，濃度為 106/ml。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可選擇 2-3x106/ml～105/ml的濃度。

3、 洗板結(jié)束后，每孔加 200μl 細(xì)胞懸液，置于潮濕的 37°C, 5% CO2 培養(yǎng)箱中�？蛇x擇加刺激對(duì)照：ConA 1-4µg/ml 刺激后孵育。

4、 孵育 2-4 天。可根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。

5、 每孔加 20μl MTT buffer 再放回至培養(yǎng)箱中孵育 4 小時(shí)。

6、 每孔加 50μl MTT 裂解液，輕輕振蕩并孵育過(guò)夜。

7、 第二天 570nm 讀板。

8、 計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差，作圖。

二、 人：

用 CD3 單抗刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）；MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖。

材料

1X 無(wú)菌 PBS

Anti-human CD3:

Clone OKT3 (Functional Grade， eBioscience Cat. No. 16-0037) or Clone HIT3a (Functional Grade， eBioscience Cat. No. 16-0039)

RPMI-1640 完全培養(yǎng)基

無(wú)菌 PBMC

96孔平底帶蓋微孔板

MTT Buffer

MTT 裂解液

儀器用具

微量移液器或排槍

離心機(jī)

37°C, CO2 培養(yǎng)箱

96 孔板讀板機(jī)

實(shí)驗(yàn)時(shí)間

30 分鐘制備 PBMCs

20 分鐘設(shè)置分析

2-4 天孵育

實(shí)驗(yàn)步驟

1、 制備PBMCs并重懸于RPMI完全培養(yǎng)基中，濃度 1-2x106/ml�？筛鶕�(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整細(xì)胞濃度至 2-3x106/ml～105/ml。

2、 每孔加 100μl 細(xì)胞懸液，每種樣品做復(fù)孔。

3、 每孔加 100μl 可溶性抗體，優(yōu)化抗體濃度。若使用分離的 T 細(xì)胞做增殖分析，推薦用 10μg/ml 抗體包被在 96 孔板上進(jìn)行刺激。

4、 放置于潮濕的 37°C, 5% CO2 培養(yǎng)箱中。

5、 孵育 2-4 天�？筛鶕�(jù)具體的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。

6、 每孔加 20μl MTT buffer 再放回至培養(yǎng)箱中孵育 4 小時(shí)。

7、 每孔加 50μl MTT 裂解液，輕輕振蕩并孵育過(guò)夜。

8、 第二天 570nm 讀板。

9、 計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差，作圖。

緩沖液和培養(yǎng)基

RPMI-1640 完全培養(yǎng)基：

900ml RPMI-1640

熱滅活的 100ml FBS（10%終濃度）

1ml 2-巰基乙醇

10ml L-谷氨酸鹽

抗生素混合物（可選）

MTT Buffer：

MTT 貯存液：溶于 1X PBS，濃度為 5mg/ml，避光保存

MTT 裂解液：

20% SDS 50% DMF

相關(guān)產(chǎn)品

廠商	目錄號(hào)	產(chǎn)品名稱(簡(jiǎn)述)	規(guī)格	目錄價(jià)
Liankebio	LK-MTT001	MTT Cell Proliferation Assay Kit	100assays	150
	LK-MTT002	MTT Cell Proliferation Assay Kit	200assays	200
	LK-MTT005	MTT Cell Proliferation Assay Kit	500assays	300
	LK-MTT010	MTT Cell Proliferation Assay Kit	1000assays	500
	LK-CCK801	Cell Counting Kit-8(CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒)	100T	200
	LK-CCK802	Cell Counting Kit-8(CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒)	200T	360
	LK-CCK805	Cell Counting Kit-8(CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒)	500T	600
	LK-CS0006	Lipopolysaccharides(LPS)脂多糖	0.5mg	90
	LK-CS0005	CONCANAVALIN A(Con A)刀豆素A	1mg	90
eBioscience	85-16-0037-85	Functional Grade Purified anti-human	500 ug	3,840
		CD3
	85-16-0039-81	Functional Grade Purified anti-human	50 ug	1,320
		CD3
	85-16-0039-85	Functional Grade Purified anti-human	500 ug	3,840
		CD3
	85-16-0031-81	Functional Grade Purified Hamster	50 ug	780
		anti-mouse CD3 (epsilon subunit; CD3e)
	85-16-0031-82	Functional Grade Purified Hamster	100 ug	1,440
		anti-mouse CD3 (epsilon subunit; CD3e)