簡介

在這篇應(yīng)用文獻(xiàn)中我們展示了基于Promega公司 GloSensor. cAMP 實驗中的修改后的發(fā)光螢火蟲熒光素酶的應(yīng)用。在FLIPR.Tetra高通量篩選系統(tǒng)進(jìn)行cAMP水平的檢測以保證在動力學(xué)模式下精確檢測Gi和Gs偶聯(lián)的GPCR活性。通過這樣的實驗，基于對細(xì)胞內(nèi)相關(guān)第二信使cAMP濃度變化的檢測可以對GPCR亞型進(jìn)行評價。Gi和Gs偶聯(lián)GPCR的第二信使信號活性的檢測傳統(tǒng)方法一般采用放射性結(jié)合或需要細(xì)胞裂解的終點法cAMP實驗方法。這些類型的實驗都是檢測一個單獨時間點下的細(xì)胞反應(yīng)和活性，不能提供動力學(xué)信息。另一種選擇時采用強(qiáng)制耦合到G_Þ16的Gs-和Gi- GPCRs，檢測受體激活后鈣離子流引發(fā)的熒光信號檢測。然而，這種方法由于不是直接的反應(yīng)cAMP通路生物相關(guān)性信號變化，只能作為第二位選擇。我們展示了穩(wěn)定表達(dá)Glosensor質(zhì)粒的CHO-K1和HEK-293細(xì)胞系中的內(nèi)源性受體活性。另外，在瞬時轉(zhuǎn)染了Glosensor質(zhì)粒的細(xì)胞系中檢測了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Gs-和Gi-偶聯(lián)受體活性。結(jié)合Glosensor cAMP方法，FLIPR^Tetra系統(tǒng)建立了一個靈活的完整解決方案用于GPCR主要亞型的動力學(xué)篩選。

如圖1所示，Glosensor cAMP檢測實驗主要通過cAMP結(jié)合域融合到野生型的螢火蟲熒光素酶的N-和C-末端來實現(xiàn)。cAMP缺乏時，基因修飾過的含有cAMP結(jié)合域的熒光素酶處于未激活狀態(tài)。一旦結(jié)合了cAMP后，cAMP結(jié)合域構(gòu)象發(fā)生變化處于激活狀態(tài)引起化學(xué)發(fā)光信號增加，從而被FLIPRTetra系統(tǒng)檢測到。更多關(guān)于Glosensor cAMP實驗的信息可參考技術(shù)手冊（Cat# TM076, Promega）。

結(jié)合質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的靈活的Gs-和Gi-偶聯(lián)的GPCR實驗設(shè)計是可行的。四種可供選擇的來自Promega的細(xì)胞系或靶標(biāo)細(xì)胞系見下：

靈活的GloSensor cAMP 實驗設(shè)計

Stable receptor and stable GloSensor cAMP assay

Transient receptor and stable GloSensor cAMP assay

Stable receptor and transient GloSensor cAMP assay

Transient receptor and transient GloSensor cAMP assay

FLIPR Tetra 系統(tǒng)：

• 超靈敏ICCD相機(jī)既可以對化學(xué)發(fā)光檢測，同時也可以檢測熒光信號

• 活細(xì)胞中動態(tài)的cAMP冷光信號檢測通過FLIPRTetra系統(tǒng)的超靈敏ICCD相機(jī)來實現(xiàn)

• 實驗通量: 96-, 384-和1536-孔記錄板規(guī)格，可很方便與自動化設(shè)備整合

材料

cAMP細(xì)胞系和質(zhì)粒

• GloSensor cAMP HEK 293 stable cell line (Promega Corporation, Cat. #E1261)

• GloSensor cAMP 23F CHO K1-stable cell line (Promega R&D)

• Rat Y2R/GloSensor cAMP 23F CHO-K1 double stable cell line (Promega R&D)

• GloSensor cAMP assay plasmid pGlosensor-22FcAMP (Promega, Cat. #E2301)

• Dopamine D4 stable HEK 293T cell line (Multispan Inc., Cat. #C1338)

細(xì)胞培養(yǎng)試劑

. HEK 293 cell growth medium: 90% DMEM (Life Technologies, Cat. #11995- 065), 10% FBS (Hyclone, Cat. #SH.30071), 200 μg/mL hygromycin B (Sigma, Cat. #H3274)

. GloSensor cAMP-23F CHO-K1 cell growth medium: 90% F-12 Medium (Life Technologies, Cat. #11765), 10% FBS, and 200 mg/mL hygromycin B)

. Glo Sensor cAMP-23F/Y2R CHO-K1 double stable cell growth medium: 90% F-12 Medium (Life Technologies, Cat. #11765), 10% FBS, and 200 μg/mL hy- gromycin B), and 500 μg/mL G418 (Life Technologies, Cat. #10131027)

實驗試劑

• Plating medium: 90% CO2-independent medium (Life Technologies, Cat. #18045), 10% FBS

• HEPES buffer: Re-suspend HEPES in deionized water to 10 mM; adjust pH to7.5 using KOH

• GloSensor cAMP Reagent stock solution: Re-suspend 250 mg GloSensor cAMP Reagent (Promega, Cat. #E1291) in 8.17 mL of HEPES buffer; store at -70°C in single-use aliquots

• 平衡溶液：種植液（見上）和2%或5% GloSensor cAMP 試劑；需根據(jù)具體實驗情況進(jìn)行優(yōu)化 • 化合物：(-)異丙腎上腺素(Sigma, Cat. #I6504); 羥甲叔丁腎上腺素(Sigma, Cat. #S8260); 普萘洛爾(Sigma, Cat. #P0884); 吲哚洛爾(Sigma, Cat. #P0778); 阿普洛爾(Sigma, Cat. #A8676); 多巴胺 (Sigma, Cat. # H8502). Peptide YY(3-36), (Tocris Cat. #1618); 所有化合物母液均配置為10 mM ，添加HBSS + 20 mM HEPES做進(jìn)一步的稀釋

方法

穩(wěn)定的GloSensor cAMP 細(xì)胞系實驗方法

Step 1. 細(xì)胞在384孔黑壁底透的細(xì)胞板（Corning, Cat. #3712）中過夜培養(yǎng)。

Step 2. 實驗前2小時，去除培養(yǎng)基并在37°C和5% CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞1小時，然后每孔加入含Glosensor cAMP試劑的平衡溶液30 μL室溫下在放置1小時。

• HEK細(xì)胞孵育在含2% Glosensor cAMP試劑的平衡溶液中

• CHO-K1 細(xì)胞孵育在5% Glosensor cAMP試劑中

Step 3. 動力學(xué)檢測過程中通過FLIPRTetra系統(tǒng)添加5X化合物

Step 4. 每10秒或30秒曝光一次，持續(xù)10-25分鐘

Step 5. 一般來說，由于較低的動力學(xué)變化Gi-偶聯(lián)的受體實驗需要更長的時間。FLIPR參數(shù)設(shè)置見表1.

Step 6. 數(shù)據(jù)結(jié)果從FLIPR的ScreenWorks®軟件輸出到Graphpad Prism 5 進(jìn)行分析

GloSensor cAMP 瞬時轉(zhuǎn)染方法用于穩(wěn)定表達(dá)GPCR受體的細(xì)胞和內(nèi)源性受體的細(xì)胞

Step 1. 在培養(yǎng)瓶中不加抗生素條件下37°C和5% CO2過夜培養(yǎng)細(xì)胞，密度可達(dá)到70-80%。

Step 2. 在Opti-Mem-無血清培養(yǎng)基中稀釋pGloSensor cAMP質(zhì)粒至20 ng/mL，使得step 4中每毫升細(xì)胞體系中含1-μg DNA/mL (Life Technologies, Cat. #31985)。

Step 3. 添加Fugene HD 轉(zhuǎn)染試劑混合物（Roche, Cat. #0409705001），比例是3:1每微克DNA并輕柔混合后室溫下孵育15分鐘。試劑(μL) 與DNA (μG)的比例是3:1。

Step 4. 添加DNA復(fù)合物至含0.48 million per mL細(xì)胞的離心管中(種植時12000 cells/25 μL/well for HEK-D4; 取決于細(xì)胞).

Step 5. 根據(jù)不同的細(xì)胞系，在每孔25微升體系中種植8000–12000個細(xì)胞，并在37°C和5% CO2條件下培養(yǎng)2天。

Step 6. 實驗當(dāng)天，輕柔的去除培養(yǎng)基并添加30μL 2–6% f/v GloSensor cAMP試劑至平衡液中。

Step 7. 37°C孵育1小時并在室溫下放置1小時。

Step 8. 參照表1中FLIPR系統(tǒng)的參數(shù)設(shè)置，在動力學(xué)檢測過程中添加6X 化合物。

表 1: FLIPR Tetra System Setup Parameters

結(jié)果

結(jié)論：

GloSensorcAMP實驗在FLIPRTetra系統(tǒng)上運(yùn)行，進(jìn)行Gi-和Gs-偶聯(lián)的GPCR受體活細(xì)胞的高通量篩選應(yīng)用。

基于 FLIPRTetra系統(tǒng) 的 GloSensor cAMP實驗可以進(jìn)行Gi-和Gs-偶聯(lián)的GPCR受體的動力學(xué)檢測而無需在酶標(biāo)儀中進(jìn)行終點法檢測。

通過本篇應(yīng)用文章，我們展示了使用 Glosensor cAMP細(xì)胞系和 Glosensor  cAMP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入內(nèi)源性受體細(xì)胞的實驗方法開發(fā)都很方便。