EMSA凝膠遷移 (Electrophoretic mobility shift assay)實驗介紹
實驗原理
凝膠遷移或電泳遷移率實驗（EMSA）是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關的DNA結(jié)合序列相互作用的技術，可用于定性和定量分析。這一技術最初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復合物和非結(jié)合的探針。DNA-復合物或RNA-復合物比非結(jié)合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當檢測如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細胞抽提液。在檢測RNA結(jié)合蛋白時，依據(jù)目的RNA結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特異），和其它非相關的片段（非特異），來確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復合物的特點和強度來確定特異結(jié)合。
通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復合物和非結(jié)合的探針。DNA-復合物或RNA-復合物比非結(jié)合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當檢測如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細胞抽提液。在檢測RNA結(jié)合蛋白時，依據(jù)目的RNA結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特異），和其它非相關的片段（非特異），來確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復合物的特點和強度來確定特異結(jié)合。
實驗試劑
重要試劑：
Boitin-N4-CTP (invitrogen # 15918-18)
TdT (NEB # M0252L)
Poly(dI.dC) (sigma ＃P4929)
Hybond-N 尼龍膜 (Amersham ＃RPN303B)
發(fā)光底物 (寧波 唯奧)
緩沖液：
緩沖液：
Buffer A (store at 4℃)
Hepes (pH7.9) 10mM
KCl 10mM
EDTA 0.1mM
DTT(fresh added) 1mM
PMSF(fresh added) 0.5mM
Buffer B (store at 4℃)
0.5M EDTA in PBS (pH7.4)
Buffer C (store at 4℃)
Hepes (pH7.9) 20mM
NaCl 0.4M
EDTA 1mM
DTT(fresh added) 1mM
PMSF(fresh added) 1mM
Buffer I (store at RT)
Tris (pH7.5) 0.1M
NaCl 1M
MgCl2 2mM
Buffer II (pH7.5) (store at RT)
馬來酸 100mM
NaCl 150mM
Buffer III (store at RT)
Tris(pH9.5) 100mM
NaCl 100mM
MgCl2 50mM
Blocking Buffer (store at 4℃)
0.3％Tween-20, 0.3%Triton X-100, 5%BSA in Buffer I
Wash Buffer
0.3％Tween-20 in Buffer II
20×SSC (1L pH7.0)
NaCl 175.3g
檸檬酸鈉 88.2g
10×Binding Buffer (store at -20℃) [在公司（碧云天）購買：5×binding buffer,內(nèi)含Poly(dI.dC)]
10×Binding Buffer (store at -20℃) [在公司（碧云天）購買：5×binding buffer,內(nèi)含Poly(dI.dC)]
Tris (pH7.5) 0.1M
KCl 0.5M
DTT 10Mm
Poly(dI.dC) (store at -20℃)
1mg/ml in TE (pH7.5)
SA-HRP(儲存液store at -20℃ 工作液store at 4℃)
1mg/ml in 50%PBS (pH7.2) 50%Glycerin
5×TBE (5L)
EDTA 18.612g
硼酸 139.1175g
Tris 272.565g
5×TdT Reaction Buffer (store at -20℃) (pH7.2)
Sodium cacodylate 0.5M
CoCl2 10mM
TCEP 1mM
Biotin-N4-CTP (store at -20℃)
Biotin-N4-CTP 50mM
Tris (pH7.5) 10mM
EDTA 1mM
實驗步驟
生物素標記探針:
1. 按如下順序加入反應物，溫和混勻，切勿渦漩
1. 按如下順序加入反應物，溫和混勻，切勿渦漩
超純水 25μl
5×TdT Reaction Buffer 10μl
探針(1μM) 5μl
Biotin-N4-CTP 5μl
TdT (2U/μl) 5μl
37℃反應30分鐘
2. 加入2.5μl 0.2M EDTA終止反應；
3. 加入50μl 酚：氯仿，短暫渦漩，15000g離心2min，保留上層水相，－20℃保存；
4. 結(jié)合反應前等體積混合兩條標記引物，90℃退火引物，并自然冷卻至4℃，待用。
抽提核蛋白：
1. 2~3×106密度鋪60mm細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)約12h；
2. 移去細胞培養(yǎng)基，PBS洗細胞一次；
3. 加入1mL Buffer B 于培養(yǎng)板，將細胞刮下收集于1.5mL離心管；
4. 1000g 離心2min，吸去上清；
5. 加入160μl Buffer A，重懸沉淀，冰育20min；
6. 加入含2.5％NP-40的Buffer A，渦漩10s，4℃ 15000g 離心5min；
7. 吸去上清，加入40μl Buffer C，4℃渦漩25min，4℃ 18000g 離心5min；
8. 吸取2μl上清采用Bradford法測蛋白質(zhì)濃度，其余儲存于-80℃。
配置非變性聚凝膠(以6％濃度為例)
5×TBE 1mL
30％Ac-Bi 2mL
40％Glycerin（甘油） 625μL
DDW （雙蒸水） 6.125mL
10%AP 150μL
10%TEMED 100μL
以預冷為4℃的0.5×TBE為電泳緩沖液，100V預電泳30-60min（時間不定，跑到溴酚藍占整塊膠的三分之二處）
EMSA（參考PIERCE公司試劑盒）
1. 特異性的證明
首次使用的探針序列需證明其是否與目的蛋白特異性結(jié)合，確定目的條帶的位置。
按照“步驟”中的體系，做以下四組平行結(jié)合實驗：
（在加入ddw，10×binding buffer，Poly(dI.dC)的基礎上)
1) 生物素標記的探針
2) 蛋白質(zhì)粗提物
3) 蛋白質(zhì)粗提物＋200倍濃度的非標記的同種探針（即冷探針）
4) 蛋白質(zhì)粗提物＋200倍濃度的非標記的突變探針（可以設計多種突變類型的探針，看是否能競爭結(jié)合）
5) 蛋白質(zhì)粗提物＋抗體
室溫反應10min，然后加入生物素標記的探針；
室溫反應10min，然后加入生物素標記的探針；
室溫繼續(xù)反應20min，做EMSA檢測。
結(jié)果分析，如果出現(xiàn)如下實驗結(jié)果
結(jié)果分析，如果出現(xiàn)如下實驗結(jié)果
1) 顯示游離探針位置
2) 顯示游離探針位置和遷移帶位置
3) 只有游離帶，沒有遷移帶
4) 和2)帶型一致
則證明探針與目的蛋白為特異性結(jié)合。
步驟：
1. 按如下順序加入反應物，溫和混勻（20μl體系）
1. 按如下順序加入反應物，溫和混勻（20μl體系）
ddw ――
10×binding buffer 2μl
Poly(dI.dC) 1μl （以上文字已說明由公司定）
核蛋白粗提物 4－10μg（溫和混勻）
生物素標記的探針 0.5μl
室溫反應20min，加入6×Loading Buffer (TAKARA) 4μl，上樣10－20μl，100V電泳至溴酚藍于三分之二處。
2. 電轉(zhuǎn)前將尼龍膜浸泡于0.5×TBE至少10min
以預冷的0.5×TBE為電轉(zhuǎn)緩沖液100V轉(zhuǎn)膠于尼龍膜上，45min。
3. UV BOX下，以貼近膜一面面向紫外光源，以254nm激發(fā)光交聯(lián)15min（紫外交聯(lián)儀1200能量，照2次）
3. UV BOX下，以貼近膜一面面向紫外光源，以254nm激發(fā)光交聯(lián)15min（紫外交聯(lián)儀1200能量，照2次）
4. 加入25mLBlocking Buffer，以約70rpm在脫色搖床上封閉30min
5. 將SA-HRP以1:30000-50000稀釋于12mL Blocking Buffer，脫色搖床70rpm作用20min
(洗膜過程全部在脫色搖床上進行, 約100-140prm)
6. Buffer II 25ml, 5min
7. wash buffer 25ml 15min
8. Buffer III 25ml 5min×2次
9. 0.1%SDS in 2×SSC, 5min×2次
10. 0.1%SDS in 1×SSC, 10min×2次
11. 0.1%SDS in 0.5×SSC, 5min×2次
12. 將膜于濾紙稍適吸干，加入到以1:20稀釋的發(fā)光反應液(寧波奧唯)，作用1-5 min，將尼龍膜封于保鮮膜中（避免褶皺和氣泡的產(chǎn)生），暗室曝光1-5min，檢測信號。
7. wash buffer 25ml 15min
8. Buffer III 25ml 5min×2次
9. 0.1%SDS in 2×SSC, 5min×2次
10. 0.1%SDS in 1×SSC, 10min×2次
11. 0.1%SDS in 0.5×SSC, 5min×2次
12. 將膜于濾紙稍適吸干，加入到以1:20稀釋的發(fā)光反應液(寧波奧唯)，作用1-5 min，將尼龍膜封于保鮮膜中（避免褶皺和氣泡的產(chǎn)生），暗室曝光1-5min，檢測信號。
注意事項
使用此protocol效果圖
圖1. 用10ng/ml的mLT-?刺激MEF細胞，分別刺激0、15、30、60、120min，檢測NF-?B的量。（p：probe only. 只加入標記探針未加入核蛋白抽提物）
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