文獻(xiàn)概述：

癌癥即惡性腫瘤，被認(rèn)為是不治之癥，但如果能將癌癥或惡性腫瘤在發(fā)病早期診斷出來，就可以爭取時間，及早治療，從而大大提高癌癥患者的存活率。雖然免疫組織化學(xué)等方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于癌癥生物標(biāo)志物的檢測中，但該方法干擾因素多，敏感性較低，癌癥階段判斷性不強(qiáng)等缺點，極易導(dǎo)致誤診。隨著納米生物技術(shù)的飛速發(fā)展，新型半導(dǎo)體納米晶體量子點逐步應(yīng)用到生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，該技術(shù)與腫瘤生物標(biāo)志物的結(jié)合，將對癌癥的發(fā)病機(jī)理研究、早期診斷、靶向治療以及預(yù)后復(fù)發(fā)檢測產(chǎn)生積極影響。

本文介紹了一種基于量子點與抗人表皮生長因子受體2(HER2)的單域抗體（sdAbs）偶聯(lián)生成超小發(fā)光納米探針的方法，并將其成功應(yīng)用于檢測肺癌和乳腺癌腫瘤細(xì)胞。研究人員首先模擬了體外腫瘤細(xì)胞生長的微環(huán)境，利用微環(huán)境培育不同的肺癌和乳腺癌細(xì)胞系，運用Western Blot以及ELISA實驗獲得不同HER2表達(dá)水平的肺癌和乳腺癌細(xì)胞系。接著采用基因工程抗體的方法制備HER2單域抗體（見圖1）：將生物標(biāo)志物HER2免疫羊駝，取羊駝血清中的淋巴細(xì)胞獲取RNA，構(gòu)建噬菌體抗體庫，通過ELISA篩選獲得活性高的抗HER2的單域抗體，最后通過測序獲得單域抗體可變區(qū)的序列。通過延伸PCR，構(gòu)建含有his-tag和cys的單域抗體（圖2），通過原核表達(dá)獲得工程化的sdAbs-SH。然后通過4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽（sulfo-SMCC）或N-(p-馬來酰亞胺基苯基)異氰酸酯（PMPI）兩種方式將sdAbs-SH與修飾氨基或羧基的量子點偶聯(lián)（圖3）。最后，用sdAbs-QDs偶聯(lián)物檢測微環(huán)境中培育的不同HER2表達(dá)水平的肺癌和乳腺癌細(xì)胞，通過激光共聚焦顯微鏡觀察肺癌和乳腺癌的染色情況，并應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析（圖5）。文章證實與傳統(tǒng)的有機(jī)染料Alexa Fluor 488、568相比，在不同HER2表達(dá)水平的肺癌和乳腺癌細(xì)胞檢測中，sdAbs-QDs偶聯(lián)物的染色效果具有明顯的優(yōu)越性。

研究者利用sdAbs-QDs偶聯(lián)物能夠檢測到癌癥細(xì)胞低水平表達(dá)的HER2，這種檢測方法兼具量子點優(yōu)良熒光特性和超小單域抗體極強(qiáng)的穿透性，從而大大提高了檢測的靈敏度。該項技術(shù)將極大的推動QDs作為標(biāo)記探針在癌癥研究和診斷方面的應(yīng)用。該文發(fā)表于ACS NANO雜志上。

圖1：單域抗體制備過程圖

（1）用感興趣的抗原免疫羊駝。
（2）利用密度梯度離心法從血液回收外周血單核細(xì)胞。
（3）通過RT–PCR方法從總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA中擴(kuò)增編碼單域抗體的基因，并克隆到噬菌粒載體。
（4）將外源基因庫sdAbs插入到外殼蛋白P3基因中，從而在輔助噬菌體的表面進(jìn)行展示。
（5）sdAb噬菌體展示庫用免疫抗原進(jìn)行吸附，沖洗掉未結(jié)合的噬菌體，將結(jié)合的噬菌體洗脫進(jìn)行富集；
（6）單克隆篩選鑒定；
（7）陽性噬菌體sdAbs感染非抑制型大腸埃希菌進(jìn)行可溶性分泌表達(dá)，純化，最后進(jìn)行SDS–PAGE分析。

圖5：量子點和傳統(tǒng)染料標(biāo)記的HER2偶聯(lián)物對與原發(fā)性巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的肺癌和乳腺癌細(xì)胞的檢測示意圖