研究人員通常會在下游分析中遭遇DNA樣本量有限或不足的問題。QIAGEN的全基因組擴增技術通過以包括單細胞在內的小量樣本或珍貴樣本擴增獲得基因組DNA，解決此類難題。REPLI-g Kit能夠準確地復制原始DNA樣本，不會造成偏差，擴增后的DNA可以直接應用于廣泛的遺傳學分析。

什么是全基因組擴增(whole gemome amplification)？
做為一種增加有限DNA量的方法，全基因組擴增技術于1992年出現，該方法特別適于法醫(yī)學鑒定和遺傳疾病的研究，以及如二代測序技術和CGH陣列（比較基因組雜交）等新技術應用，后者的主要難題就在于DNA樣本數量有限，但分析需求量又很可觀。目前業(yè)界已經開發(fā)出多種WGA技術，它們之間的實驗方案和復制準確度有所不同。

WGA技術——PCR技術與多重置換擴增（MDA）技術的比較 
業(yè)界已經開發(fā)出多種WGA技術；不過這些技術在其擴增準確性和易用性等方面有所區(qū)別。QIAGEN的REPLI-g Kit采用被稱為多重置換擴增的WGA技術，能夠提供無偏差的準確全基因組擴增。 

基于PCR的WGA技術

基于PCR的WGA技術主要有兩種：簡并寡核苷酸PCR (DOP-PCR)技術(1)和擴增前引物延伸(PEP)技術(2)。這兩種技術之間的主要區(qū)別在于PEP技術使用隨機引物和低PCR退火溫度，而DOP-PCR技術則使用半簡并寡核苷酸（例如CGACTCGAGNNNNNNATGTGG）和更高的退火溫度。兩種方法中都使用了Taq DNA聚合酶，使得擴增長度限制在3 kb（平均片段長度為400–500 kb）以內，并且會在擴增序列中引入一些錯誤。不僅如此，有研究發(fā)現這些技術的基因組覆蓋度不夠完整，并會在擴增中產生偏向性——由于引物優(yōu)先結合某些特定區(qū)域，造成DNA擴增產物中的一些序列相對增多。

多重置換擴增的WGA技術

REPLI-g使用了稱為多重置換擴增(MDA)的恒溫基因組擴增技術，該技術包含了隨機六聚體與變性DNA的結合過程，以及使用Phi 29聚合酶在恒定溫度下進行的鏈置換合成過程。每個置換鏈上添加引物后，形成分枝狀的DNA結構網絡。Phi 29聚合酶不會從基因組DNA模板上面解離下來，這使得生成的無偏差DNA片段可延伸至100 kb。該酶還具有3’端→5’端的外切酶校正活性，相比基于Taq DNA聚合酶的方法，能夠提供高達1000倍的保真度（參見上述基于PCR的WGA技術）。Phi 29聚合酶由獨特的REPLI-g優(yōu)化緩沖液進行支撐，能夠方便的克服如發(fā)卡環(huán)一類的二級結構困難，在擴增過程中避免滑脫、定制和聚合酶解離等現象的發(fā)生。這樣無偏差的DNA片段能夠合成至100 kb的長度。 

MDA技術與基于PCR的WGA方法相比的優(yōu)勢

傳統(tǒng)的基因組DNA擴增方法包括費時的EBV轉化細胞系建立過程，以及之后使用隨機或簡并寡核苷酸引物進行的PCR全基因組擴增步驟。為其他廠商所普遍采用的基于PCR的WGA法，也會產生非特異性的擴增干擾以及不完全的位點覆蓋度。某些案例中可能生成短于1 kb長度的DNA片段，在很多后續(xù)應用中無法使用。通常情況下，由于使用了低保真度的Taq DNA聚合酶，使生成的DNA中包含了很高的堿基突變率，因此形成了容易出錯的擴增，導致如單堿基對突變、STR縮短和擴張等不良后果的發(fā)生。REPLI-g則沒有這些缺點，它能對整個基因組進行高度均一的擴增，反應過程中位點序列的偏差及突變率達到最小。

WGA技術的應用
使用REPLI-g擴增后的基因組DNA適于進行多種多樣的后續(xù)應用，包括：

• 使用TaqMan引物/探針套裝進行SNP基因分型
• 基于qPCR和PCR技術的突變檢測
• 二代測序
• STR/微衛(wèi)星序列分析
• Sanger測序
• RFLP和Southern印跡分析
• 如比較基因組雜交一類的芯片分析技術

以上信息來源于QIAGEN:http://www.qiagen.com/cn/resources/technologies/wga/overview-on-wga/

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