DNA甲基化是基因組DNA的一種主要表觀遺傳修飾形式。近年來,大量研究表明DNA甲基化修飾對于維持正常細(xì)胞功能、傳遞基因組遺傳印記、胚胎發(fā)育以及人類腫瘤發(fā)生,起著至關(guān)重要的作用,由此甲基化研究成為表觀遺傳學(xué),乃至生命科學(xué)研究的熱點領(lǐng)域。
那么如何檢測單個基因或者全基因組的甲基化水平或者甲基化位點呢?
當(dāng)前科研領(lǐng)域最常用的檢測方案是使用亞硫酸鹽將DNA中未甲基化的胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)化為尿嘧啶(U),而甲基化的胞嘧啶則保持不變,通過設(shè)計特異性的甲基化引物,進(jìn)行甲基化特異性-PCR或者亞硫酸鹽測序法,從而達(dá)到實驗?zāi)康摹D敲慈绾未_保DNA中未甲基化的胞嘧啶100%完成了轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化過程中防止DNA降解,以及轉(zhuǎn)化后DNA的有效回收成了其中關(guān)鍵!
許多研究人員都會在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化之前富集甲基化的DNA。一來可降低背景,二來也可節(jié)約成本。目前有兩種基本方法,一個是利用5’-甲基胞嘧啶的抗體來捕獲甲基化DNA,即甲基-DNA免疫沉淀(MeDIP);另一個是利用包含了甲基-CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域(MBD)的蛋白來得到同樣的結(jié)果。
目前市場上的大部分產(chǎn)品都是利用后一種方法。這兩種方法的差別在于MeDIP是在單鏈DNA的背景下特異識別5’-甲基胞嘧啶,而后者更偏愛雙鏈DNA。MBD的另外一個優(yōu)勢是:在利用蛋白酶K將免疫沉淀后的DNA洗脫下來時,MBD2中的甲基化DNA可根據(jù)鹽梯度而逐步釋放。這樣,你就能區(qū)分不同程度的甲基化DNA。
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Figure.2 試劑盒操作流程示意圖 Figure.3 轉(zhuǎn)化后DNA,qPCR驗證的效果圖
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