作者：Suzanne kennedy 來源：美國MoBio實驗室【字號：大 中 小】

接著前一篇文章關(guān)于如何提高土壤DNA提取得率的話題。我們已經(jīng)十分徹底的談了樣品研磨裂解、選擇研磨珠類型的重要性、研磨設備以及裂解緩沖液。從中你也可以發(fā)現(xiàn)，裂解步驟是提高得率的最值得鉆研的地方。

研磨裂解后最終DNA抽提前，需要清洗去雜。這一步主要由抑制因子去除技術(shù)（IRT）完成。跟著操作說明書流程走，抑制因子去除完成后，文章的再下一段就是使用化學溶液配合硅膠離心柱抽提DNA了。

去除抑制因子：

把土壤樣品研磨破碎后就可以進行PCR抑制因子去除工作。所謂的腐植酸其實就是使得樣品呈現(xiàn)棕色的物質(zhì)。如果樣品中有植物殘骸甚至生物薄膜（Biofilm），雜質(zhì)中還會含多糖類物質(zhì)。MO BIO以及Powersoil kits之所以在同行、同類試劑盒中出類拔萃就是因為其抑制因子去除。MO BIO實驗室開發(fā)出了一個專利技術(shù)，叫抑制因子去除技術(shù)（IRT）。它能從細胞裂解物中沉淀去除腐植酸、多糖、多酚等。IRT技術(shù)分兩步，先去除蛋白質(zhì)和其它殘骸，然后去除不溶性大分子絮狀沉淀物。IRT處理后，樣品看起來就清亮很多了。PowerSoil 和 PowerWater 經(jīng)過實驗計算使用了充足的IRS量來對付最最難搞的問題土壤。若最終依然存在有抑制因子（PCR擴增檢測），重復一次IRS步驟。

IRT的第一步需要低溫來加強絮狀物形成。而第二步，我們建議不要延長孵育時間超過5min。試驗證明過長孵育時間會降低DNA得率。

中點？

如果要臨時中止實驗，時間點最好是在IRS結(jié)束后，加入綁定液之前。把溶解產(chǎn)物存放在-20℃留到第二天再做硅膠離心柱綁定。

綁定到硅膠薄膜上：

此時，DNA已經(jīng)可以過硅膠薄膜用于抽提了。一般上一步得到的細胞裂解產(chǎn)物應該是清亮的（如果土壤有機物含量很多，有可能微微發(fā)黃）。為了把DNA吸附到硅膠薄膜上，需要離液鹽的幫助。綁定液（C4溶液）與溶解產(chǎn)物的比例是得率的又一關(guān)鍵點。綁定液用太多，會導致降解RNA過多回收；要是太少，大分子量的基因組DNA回收率就不高。所以，我們建議一個2ml Tube管，放750μl溶解產(chǎn)物，1.2ml綁定液。

如果實驗過程中發(fā)現(xiàn)溶解產(chǎn)物不止750μl，那么你就需要相應地提高綁定液的量�；蛘哒f綁定液（C4溶液）2倍體積于溶解產(chǎn)物，這個比例最合適。這樣的話，就需要把溶解產(chǎn)物分開到兩個2ml Tube收集管，或者用大號Tube（5mL或15mL），并保證溶液充分混勻。

真空泵適配器(Vacuum Manifold )，可選：

通常情況下，吸附綁定到離心柱步驟需要加樣3次。一個提高工作效率的辦法就是試用PowerVac Manifold System.。如果你的實驗室里頭已經(jīng)有了vacuum manifold ，那就只需要一套PowerVac Mini Spin Filter適配器。我們在實驗室里就是通過這個方法提高工作速度。如果你需要處理超過建議量750μl的溶解產(chǎn)物和相應增加的綁定液，那么采用vacuum manifold就可以在加樣4-5次的同時節(jié)約大量時間。

清洗:

因為IRT的緣故，土壤中的所有污染物都已經(jīng)被去除干凈，而無需像其它品牌試劑盒那樣使用額外的高鹽。此步驟的主要目的是去除殘留在柱子上的離液鹽。若不去除這些離液鹽，DNA就很不容易洗脫下來，就算洗脫下來了也會被胍污染。清洗緩沖液中含有酒精成分可以溶解并洗掉殘留的鹽。通常清洗一次就可以了。要是發(fā)現(xiàn)260/230讀數(shù)偏低（Nanodrop讀數(shù)中230吸光率偏高），請再清洗一遍。如果發(fā)現(xiàn)清洗緩沖液用完了，100%無水乙醇同樣可以作為替代來沖洗濾膜。vacuum manifold 操作說明中就有用到100%無水乙醇。

沖洗完了以后，記得甩干離心柱上的酒精。因為殘留的酒精會影響DNA的抽提效率。

抽提:

最后一步是把DNA釋放到10 mM Tris pH 8.0緩沖液中。DNA在中性或偏弱堿性的環(huán)境下容易降解。你可能會考慮使用水來稀釋一下，但通常水pH值偏低（約4-5），效果可能不太理想。抽提過程中一個增加得率的小提示就是，在加入緩沖液后，離心前，室溫孵育離心柱濾膜。1-5min的孵育可以幫助重懸濃縮DNA到一個更小的體積。但還是建議DNA抽提最終體積不要小于50μl，否則會殘留大量DNA。

現(xiàn)在，你的DNA已經(jīng)可以馬上已經(jīng)PCR擴增或者跑膠了。

常見問題：

通常土壤中有多少DNA？

討論了那么多，你也許最想問的是，到底土壤一般含有多少DNA？答案是不定。土壤的含水量、有機物含量以及采集地點都會有影響。

在我們的實驗室里頭，"一般土壤"如園土，DNA得率可以達到2-5μg/0.25g（每個樣）。我們也計算過大田土壤如草莓園，得率就很低，知道0.25μg/0.25g（每個樣）。對于砂土、粘土等有機物含量較低的土壤類型，得率可能會更低。

我怎么做才能提高粘土和砂土的得率？

關(guān)于粘土和砂土的一個理論認為，釋放出來的部分核酸被牢牢地綁定到了土壤本身里頭去。文章結(jié)尾列舉了幾個文獻關(guān)于防止微生物DNA損失的前處理方法。其中包括使用脫脂奶（1）。有證據(jù)表明二價陽離子在DNA吸附到土壤表面起了關(guān)鍵作用（2）。因此，有些客戶在裂解步驟往研磨管中加入了EDTA并成功地最終獲得50mM濃度的DNA。

總結(jié)：

文章中已經(jīng)包含了我們所知道所有提取土壤DNA的技術(shù)提示和技巧�？偟膩碚f，不同土壤類型有其特點和微生物含量，以此預估DNA得率。而獲得高得率和完整DNA關(guān)鍵步驟就是研磨和吸附綁定階段。如果你的最終得率沒有達到預期，解決思路就圍繞著兩點吧。請切忌，盲目提高土壤樣品起始量并不能得到更多DNA。

我們一直非常樂意傾聽您使用MO BIO試劑盒獲得更好結(jié)果的意見和意見。請給我們寫信，告訴我們你提取土壤樣品DNA的獨特技巧。

感謝你的耐心閱讀！

參考文獻：

• Microbes and EnvironmentsVol. 19 (2004) , No. 1 pp.13-19An Improved DNA Extraction Method Using Skim Milk from Soils That Strongly Adsorb DNAYuko Takada-Hoshino and Naoyuki Matsumoto
• FEMS Microbiology LettersVolume 97 Issue 1-2, Pages 31 - 39Adsorption of DNA on clay minerals: protection against DNaseI and influence on gene transferEric Paget, Lucile Jocteur Monrozier, and Pascal Simonet