β-內(nèi)酰胺酶單克隆抗體和多克隆抗體的制備

目前，在我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)中，青霉素和頭孢菌素等β-內(nèi)酰胺類抗生素對奶牛乳房炎等疾病的控制起著十分重要的作用。由于一些奶牛養(yǎng)殖商戶濫用抗生素以及未嚴格遵守休藥期，致使牛奶中抗生素殘留超標，乳中殘留的抗生素嚴重危害食品安全和人體健康。我國政府對超過一定限量抗生素的原料乳實施標準控制。國內(nèi)多數(shù)乳品企業(yè)對抗生素殘留超標的牛乳采取降價收購或不收購，而一些不法奶站使用一些生物制劑降解牛乳中殘留的抗生素，生產(chǎn)出人造"無抗奶"。

經(jīng)過調(diào)研，初步判斷市售生物制劑的主要成分是β-內(nèi)酰胺酶，它是由革蘭氏陽性細菌產(chǎn)生和分泌的多種酶組成的酶家族，相對分子質(zhì)量在28～32ku之間，可選擇性分解牛奶中殘留的β-內(nèi)酰胺類抗生素。β-內(nèi)酰胺酶能夠破壞青霉素內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)，使其失去活性。該酶的使用掩蓋了牛奶中實際含有的抗生素。崔生輝等人2007年曾在北京零售超市中采集5個廠家生產(chǎn)的、不同種類的牛奶樣品38個，其中63.2%的樣品檢測出β-內(nèi)酰胺酶。β-內(nèi)酰胺酶為我國禁用的食品添加劑之一，它可導(dǎo)致青霉素、頭孢菌素等抗生素類藥物耐藥性增高，從而大大降低人們抵抗傳染病的能力，給消費者的身心健康帶來危害。我國于2009年和2011年公布的食品和飼料中非法添加的非食用物質(zhì)名單中，β-內(nèi)酰胺酶（金玉蘭酶制劑）兩次上榜，且認定的檢測方法為液相色譜法。

原乳中β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法有微生物杯碟法、快速試劑盒法、液相色譜法和雙流向酶聯(lián)免疫法。微生物杯碟法成本低廉。試劑盒法和酶聯(lián)免疫法依據(jù)抗原抗體特異性反應(yīng)的基本特性，操作簡單，速度快，特異性好。液相色譜法具有操作時間短、靈敏度高、準確的特點，但所需實驗儀器要求較高。

本研究中制備β-內(nèi)酰胺酶的多克隆抗體和單克隆抗體，擬通過雙抗夾心法為后續(xù)的膠體金免疫層析試紙條的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗動物：日本大耳兔（雌性，兩月齡），北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限責任公司；Balb/C小鼠（雌性，SPF級，六周齡）、昆明小鼠（18～22g），購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。

實驗試劑：β-內(nèi)酰胺酶，Sigma公司；青霉素酶，中國藥品生物制品檢定所；牛血清白蛋白（BSA）、脫脂奶粉，北京經(jīng)日今典科技有限公司；單組份TMB顯色液，北京索萊寶科技有限公司；辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG、辣根過氧化酶標記的羊抗鼠IgG，北京優(yōu)博奧生物科技有限公司；HAT、 HT、PEG2000、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，Sigma公司；小鼠SP2/0細胞，本實驗室保存；DMEM低糖培養(yǎng)基，GIBCO公司；小鼠單克隆抗體亞型試劑盒，洛陽賽爾維實驗器材有限公司。

儀器和設(shè)備：96孔聚苯乙烯酶標板、細胞培養(yǎng)板，JETBIOFIL公司；酶聯(lián)免疫檢測儀、凝膠成像儀，BIO-RAD公司；紫外分光光度計，UNICO公司。

1.2 免疫抗原的選擇

使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析β-內(nèi)酰胺酶和青霉素酶兩種蛋白的分子質(zhì)量及純度。分離膠10%，積層膠4%，電泳緩沖液為甘氨酸。

1.3

使用β-內(nèi)酰胺酶對3只日本大耳兔進行免疫。對每只大耳兔，取700μgβ-內(nèi)酰胺酶，用pH7的0.1mol/LTris-HCL稀釋至 500μL，與等體積的弗氏完全佐劑混合，充分乳化后于兔子背部皮下和兩側(cè)腹股溝多點注射。之后的加強免疫使用同劑量免疫原與等體積的弗氏不完全佐劑充分乳化，背部皮下多點注射，每次免疫間隔兩周。自第3次免疫起，每次免疫4d后于兔子耳緣靜脈采血，分離血清，檢測免疫效果。五免后3d心臟采血，分離血清。

1.4 ELISA篩選方法的建立

1.4.1 包被原濃度的確定采用方陣法，用系列濃度稀釋的青霉素酶橫向包被96孔酶標板，將倍比稀釋的一抗縱向加入，用間接ELISA法確定最佳抗原包被濃度。

1.4.2 包被條件的確定選擇4℃overnight，37℃1h，37℃2h3種方式包被，以確定最佳包被條件。

1.4.3 封閉液的選擇選擇0.2%明膠、5%脫脂奶粉、3%山羊血清、5%小牛血清、0.75%奶粉+2%BSA+5%蔗糖、3%BSA+0.05%吐溫+3%蔗糖、5%奶粉+0.05%吐溫+3%蔗糖7種封閉液封閉，確定最佳封閉液。

1.4.4 封閉時間的優(yōu)化封閉時間選擇0.5，1，2h，采用間接ELISA確定最佳封閉時間。

1.5

1.5.1動物免疫將9只雌性Balb/C小鼠分為3組，高、中和低3個劑量組每次免疫分別為200，100和50μg/只。首次免疫取相應(yīng)劑量的 β-內(nèi)酰胺酶，溶于50μl 0.1mol/L Tris-HCL（pH7）中，于等體積的弗氏完全佐劑充分乳化后小鼠后頸背部多點注射。兩周后使用同劑量免疫原與弗氏不完全佐劑乳化作第2次免疫，于腹腔皮下注射。第

3次免疫后，ELISA法檢測小鼠抗血清的效價。在3組中選取效價最高的小鼠做融合，融合前3d腹腔注射相同劑量的抗原液作加強免疫。

1.5.2 SP2/0骨髓瘤細胞的培養(yǎng)用8-氮雜鳥嘌呤（20μg/mL）處理3代體外培養(yǎng)的SP2/0骨髓瘤細胞，對數(shù)生長期時皮下注射Balb/C小鼠背部兩側(cè)，每只小鼠注射5×105～1×106個細胞。實體瘤直徑長至2～3cm時，無菌解剖摘取，200目的篩網(wǎng)研磨過濾，重新培養(yǎng)至細胞穩(wěn)定生長。

1.5.3 細胞融合融合前1d使用昆明鼠培養(yǎng)飼養(yǎng)細胞。取對數(shù)生長期的SP2/0骨髓瘤細胞與免疫小鼠的脾細胞，用50％PEG2000按常規(guī)方法融合，使用建立的青霉素酶間接ELISA法檢測培養(yǎng)上清。選擇強陽性孔，用有限稀釋法連續(xù)亞克隆4～5次，直至克隆孔100％分泌抗β-內(nèi)酰胺酶抗體。將建立的穩(wěn)定、高效價分泌抗β-內(nèi)酰胺酶單克隆抗體的雜交瘤細胞株擴增培養(yǎng)，傳3代及凍存復(fù)蘇后仍能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株，然后置液氮中保存。

1.5.4 腹水采用體內(nèi)誘生法制備腹水。取Balb/C小鼠腹腔注射滅菌石蠟油0.5mL/只，兩周后注射抗β-內(nèi)酰胺酶的雜交瘤細胞5×105個/只，1周后收集小鼠腹腔液。

1.6 抗體的特性分析

使用間接ELISA法對多克隆抗體和腹水中的單克隆抗體效價進行測定，多克隆抗體以空白血清作陰性對照，單克隆抗體以SP2/0骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清為陰性對照；采用非競爭酶免疫試驗對單克隆抗體的親和力進行測定；使用亞型鑒定試劑盒對雜交瘤細胞株進行亞型鑒定。采用秋水仙素裂解法對雜交瘤細胞株進行染色體分析。使用Westernblotting對單克隆抗體的分子質(zhì)量和特異性進行測定。

1.7 抗體純化

1.7.1 多克隆抗體的純化采用辛酸-飽和硫酸銨法純化抗β-內(nèi)酰胺酶的兔血清，2次滴加飽和硫酸銨的最終體積分數(shù)分別為50%和40%。將沉淀用少量PBS溶解后轉(zhuǎn)入透析袋中，用PBS溶液透析48h，利用紫外分析法檢測透析液直至透析完全。

1.7.2 單克隆抗體的純化采用PEG6000沉淀法純化Balb/C小鼠的腹水，沉淀用50mmol/LTris-HCL溶液（pH8.0）溶解，冰浴除雜蛋白，即得粗提單克隆抗體，用SDS-PAGE對抗體純度進行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫原

通過SDS-PAGE分析β-內(nèi)酰胺酶和青霉素酶，兩種蛋白的分子質(zhì)量及純度見圖1。兩種蛋白在分子質(zhì)量為30ku處均有明顯的蛋白表達，分子質(zhì)量數(shù)據(jù)與預(yù)期相符。β-內(nèi)酰胺酶經(jīng)SDS-PAGE分析，純度達100%，與說明書一致。青霉素酶經(jīng)Bandscan軟件分析，純度達61.4%，含有大量雜蛋白。使用純度較好的β-內(nèi)酰胺酶作為免疫原。

2.2 兔抗β-內(nèi)酰胺酶多克隆抗體效價

4免后，3只日本大耳兔的效價分別為1×106，2×106，1×106（見圖2）。其中2號大耳兔的效價最高，選取2號大耳兔的血清做ELISA的優(yōu)化實驗。

2.3 ELISA篩選方法

2.3.1 包被原濃度采用方陣法，用系列濃度稀釋的青霉素酶橫向包被96孔酶標板，將倍比稀釋的一抗縱向加入（用"+"表示），每組加入50μg/mL的青霉素酶做抑制試驗（用"-"表示），使用間接ELISA法確定最佳抗原包被濃度。當包被原質(zhì)量濃度為5μg/mL，兔血清質(zhì)量濃度為1∶64000時，OD450 接近1，且抑制效果最好。使用5μg/mL青霉素酶作為包被原。

2.3.2 包被條件選擇4℃overnight，37℃1h，37℃ 2h 3種方式包被，以確定最佳包被條件。根據(jù)P/N的比值，確定4℃overnight為最佳包被濃度。

2.3.3 青霉素酶結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含雜蛋白。7種封閉液中，使用3%BSA+0.05%吐溫+3%蔗糖封閉，特異性最好，封閉效果最佳。

2.3.4 封閉時間采用間接ELISA確定最佳封閉時間。當封閉時間2h時，陰性值較低，P/N比值為最大，封閉效果最佳。

2.4單克隆

2.4.1 BALB/C小鼠免疫效果從免疫結(jié)果看，低劑量組（50μg/只）Balb/C小鼠產(chǎn)生抗體的效價最高，達1:128000。同時比較Balb/C小鼠的精神狀態(tài)，低劑量組較中、高劑量組的Balb/C小鼠體態(tài)活躍，被毛光亮。使用低劑量組的Balb/C小鼠脾臟進行融合。

2.4.2 細胞篩選及亞克隆細胞融合后， 融合率為80%，陽性率為20.5%。經(jīng)4 次亞克隆，陽性率為100%，篩選出能穩(wěn)定分泌抗β-內(nèi)酰胺酶抗體的3株陽性細胞株，分別命名為C1，D1，F(xiàn)8。將F8連續(xù)傳代3 周及凍存復(fù)蘇后，檢測ELISA 效價，結(jié)果基本不變，說明所獲雜交瘤細胞株穩(wěn)定。

2.5 抗體特性分析

2.5.1小鼠腹水中單抗效價及親和力測定結(jié)果用間接ELISA法檢測3株雜交瘤細胞無血清培養(yǎng)基上清效價（1∶32）～（1∶512）。將3株雜交瘤細胞均腹腔注射獲取腹水，3株雜交瘤細胞株中F8腹水的效價最高，選擇F8做后續(xù)實驗。采用非競爭酶免疫試驗進行測定。經(jīng)親和力常數(shù)公式計算，F(xiàn)8的親和力為6.4×107L/mol。

2.5.2 3株雜交瘤細胞亞型的鑒定結(jié)果使用單克隆抗體亞型鑒定試劑盒，對篩選出的3株單抗C1，D1，F(xiàn)8進行亞型鑒定，這3株雜交瘤細胞均屬于IgM 亞型。

2.5.3 F8雜交瘤細胞株染色體的分析 計數(shù)100體數(shù)目總和基本一致（已知SP2/0細胞染色體數(shù)個處于有絲分裂中期的完整F8細胞，染色體數(shù)目62～68條，Balb/C小鼠脾細胞的染色體數(shù)目為96～104條（圖7），與SP2/0細胞和脾細胞的染色40條）。

2.5.4 Western-Blotting檢測F8的特異性Westernbloting鑒定表明，F(xiàn)8 腹水可與β-內(nèi)酰胺酶和青霉素酶發(fā)生特異性反應(yīng)（圖8），說明F8是針對β-內(nèi)酰胺酶和青霉素酶的特異性抗體。

2.6 F8雜交瘤細胞株單克隆抗體的純化

比較了辛酸-冷酒精法、辛酸-飽和硫酸銨法、PEG60003種方法，經(jīng)PEG6000方法純化的單克隆抗體雖然純度不高，但抗體效價保存最好。

3討論

金屬β-內(nèi)酰胺酶是一類活性依賴二價金屬陽離子的β-內(nèi)酰胺酶，該酶廣泛水解（包括碳青霉烯類、廣譜頭孢菌素類等）多種β-內(nèi)酰胺類抗生素，對常用 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑（如克拉維酸、舒巴坦等）不敏感。依據(jù)分子生物學(xué)，Bush于1997年將當時有序列資料的12種金屬酶分成3個亞群：B1，B2，B3。絕大多數(shù)金屬酶屬于B1亞群，該亞群的各種酶分子質(zhì)量相近（約為28ku），序列一致性大于23%。B2亞群與B1亞群的分子大小相近，但同源性較低。B3亞群只有9個氨基酸與其它金屬酶顯著不同，單體分子質(zhì)量為31.7ku。雖然各亞群金屬酶之間的氨基酸序列同源性不高，但是酶蛋白形成的立體結(jié)構(gòu)卻很類似，金屬酶中的關(guān)鍵殘基，尤其是形成金屬鍵的氨基酸殘基高度保守。鑒于β-內(nèi)酰胺酶的結(jié)構(gòu)特點，選擇純度較好的β-內(nèi)酰胺酶作為免疫原。為了使篩選的單克隆抗體能更好地識別β-內(nèi)酰胺酶，使用中檢所的青霉素酶作為包被原。目前，市售β-內(nèi)酰胺酶檢測膠體金試紙條多數(shù)采用的是間接法。間接法是利用β-內(nèi)酰胺酶酶解青霉素的原理，將牛奶樣品與微量青霉素混勻反應(yīng)。如果牛奶中存在一定濃度的β-內(nèi)酰胺酶，那么青霉素經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶酶解后濃度減少。用試紙條檢測青霉素，判斷牛奶中是否存在β-內(nèi)酰胺酶，但是待測樣品要經(jīng)過多次離心、孵育等工序處理后方可使用試紙條進行檢測。而本研究通過研制抗β-內(nèi)酰胺酶的單克隆抗體和多克隆抗體，使用雙抗夾心法，膠體金試紙條直接檢測。該方法的優(yōu)勢是減少反應(yīng)時間，優(yōu)化反應(yīng)步驟。

另外，細菌耐藥也能產(chǎn)生內(nèi)源性β-內(nèi)酰胺。牛奶中內(nèi)源性β-內(nèi)酰胺酶的來源主要有2種途徑：一是牛體本身產(chǎn)生的，二是牛本身感染的某些有抗性的微生物在體內(nèi)不斷分泌表達β-內(nèi)酰胺酶。目前尚未有能區(qū)分產(chǎn)品中所含β-內(nèi)酰胺酶是人為添加還是耐藥細菌產(chǎn)生的報道，這是監(jiān)管β-內(nèi)酰胺酶的一個新難題。只有加強畜牧業(yè)、奶業(yè)生產(chǎn)全過程管理，提高養(yǎng)殖人員的安全責任心，才是消除抗生素殘留，保障牛奶和奶制品安全的根本。