多數(shù)細(xì)胞系和原代細(xì)胞都會(huì)以一種單層的形式生長(zhǎng)（單層細(xì)胞）或者覆蓋在玻璃或經(jīng)處理的塑料物體表面。為了保持細(xì)胞的健康與活躍增殖，通常需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行有規(guī)律的傳代。

最常見(jiàn)的傳代方法是使用蛋白酶如胰酶或膠原酶破壞細(xì)胞間以及細(xì)胞與培養(yǎng)介質(zhì)間的連接。當(dāng)細(xì)胞被解離成單細(xì)胞懸液時(shí)，再將它們稀釋并分發(fā)至新的培養(yǎng)容器中。在那里，細(xì)胞可以重新貼壁生長(zhǎng)和分裂，然后經(jīng)過(guò)一段時(shí)間培養(yǎng)，細(xì)胞又再一次長(zhǎng)滿（接近匯合）。此時(shí)，細(xì)胞又需要進(jìn)行傳代或用于下游實(shí)驗(yàn)。
注意：以下指南描述了典型單層細(xì)胞的常規(guī)傳代與維持的基本原則。為了得到一致的結(jié)果，堅(jiān)持良好的培養(yǎng)記錄非常重要，記錄應(yīng)包括細(xì)胞傳代的日期和傳代的次數(shù)。
細(xì)胞的檢查：應(yīng)該養(yǎng)成良好的習(xí)慣對(duì)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)的和認(rèn)真的檢查，以了解它們的狀態(tài)和健康情況。

首先，用肉眼檢查培養(yǎng)容器中是否存在可見(jiàn)的微生物污染，比如培養(yǎng)基pH改變、渾濁或有顆粒樣的物體。同時(shí)也要注意觀察有沒(méi)有小的真菌菌落，因?yàn)樗鼈冊(cè)陲@微鏡下不易被發(fā)現(xiàn)。這些菌落可能會(huì)飄浮在液體表面，特別是在培養(yǎng)容器周邊附近。
其次，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞常規(guī)形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)，留意檢查任何鏡下可見(jiàn)的微生物污染的跡象。在某些細(xì)胞系中，培養(yǎng)液中漂浮的細(xì)胞通常是死亡的細(xì)胞。但是，許多細(xì)胞在進(jìn)行有絲分裂的時(shí)候也會(huì)變圓，形成折光性很強(qiáng)（很亮）的球體，并且在受到擾動(dòng)后也會(huì)飄浮起來(lái)。兩者的區(qū)別在于，死細(xì)胞通常會(huì)變圓脫落但一般折光性不會(huì)很強(qiáng)。

除了這些日常檢查外，還需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行周期性的真菌、細(xì)菌以及支原體檢查。
培養(yǎng)液的準(zhǔn)備：準(zhǔn)備針對(duì)特定細(xì)胞系在購(gòu)買(mǎi)或文獻(xiàn)中推薦使用的新鮮培養(yǎng)液，并用記號(hào)筆在培養(yǎng)容器上標(biāo)記傳代時(shí)間和細(xì)胞代數(shù)等信息。確保添加了補(bǔ)充成分（如：谷氨酰胺、生長(zhǎng)因子、抗生素等）并且預(yù)先放置培養(yǎng)箱進(jìn)行了pH平衡。一個(gè)75cm²的培養(yǎng)瓶大約需要12-15ml培養(yǎng)液，如何使用其他規(guī)格的培養(yǎng)容器需要進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。

收集細(xì)胞：

大多數(shù)的細(xì)胞在完全生長(zhǎng)匯合前（還有一些生長(zhǎng)的空間）進(jìn)行細(xì)胞傳代，可以達(dá)到最佳的生長(zhǎng)狀態(tài)，因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)胞是處在活躍的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。實(shí)驗(yàn)中觀察到的任何異�，F(xiàn)象都應(yīng)該被記錄在每個(gè)細(xì)胞系特定的記錄本上。

細(xì)胞的最佳收集方法的制定原則是以最輕柔的方式破壞細(xì)胞與培養(yǎng)容器以及細(xì)胞之間的連接。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞而言，這就需要使用含化學(xué)試劑或酶的消化液。胰酶是最常用的消化液，它的常規(guī)用量在0.05%到0.25%之間。胰酶的最佳工作濃度通常是指可在較短時(shí)間內(nèi)（10-15min），使細(xì)胞從培養(yǎng)容器壁上脫落形成單細(xì)胞懸液的最低濃度。某些細(xì)胞相對(duì)其他的細(xì)胞更難以消化，此時(shí)通常在胰酶中還需要添加膠原酶或螯合劑如EDTA等，以提升消化能力。
當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)在含哺乳動(dòng)物源性血清的培養(yǎng)液時(shí)，細(xì)胞需要首先進(jìn)行清洗以除去血清，因?yàn)檠�清的存在�?huì)抑制胰酶的活性。血清殘留是胰酶消化失敗的常見(jiàn)原因。細(xì)胞消化時(shí)，要求使用不含鈣和鎂離子的緩沖液，因?yàn)檫@兩種離子在細(xì)胞間以及細(xì)胞與培養(yǎng)容器間的吸附中發(fā)揮重要作用。
單層細(xì)胞的收集：

1.去除細(xì)胞培養(yǎng)液
2.加入5ml消化液清洗細(xì)胞一次，然后吸除（該方法的試劑用量是針對(duì)75cm²培養(yǎng)瓶，如果使用其他培養(yǎng)容器需要適當(dāng)?shù)脑黾踊驕p少試劑的用量）。如果消化液中包含胰酶，就需要清除所有的血清殘留，因?yàn)檠�清中含有胰酶抑制劑。（注：這里也可以使用DPBS清洗1-2次，節(jié)約點(diǎn)消化液）
3. 加入2-3ml消化液，每隔5min在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的消化情況。對(duì)于特別難以消化的細(xì)胞，可以在37度進(jìn)行消化。對(duì)消化液進(jìn)行預(yù)熱可以減少消化時(shí)間，為了避免細(xì)胞成團(tuán)，在等待細(xì)胞脫落的過(guò)程中不要敲擊或搖晃培養(yǎng)瓶。
4. 使用移液管向細(xì)胞懸液中加入6-8ml生長(zhǎng)培養(yǎng)液，吹打培養(yǎng)瓶底部收集所有殘留的細(xì)胞。此時(shí)，在倒置顯微鏡下進(jìn)行簡(jiǎn)單觀察應(yīng)該看到細(xì)胞懸液中至少95%的細(xì)胞為單細(xì)胞。如果不是，可能需要進(jìn)一步進(jìn)行吹打。
5. 收集細(xì)胞懸液，按需求進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)或者等分，然后分發(fā)至準(zhǔn)備好的培養(yǎng)容器中。對(duì)于一些細(xì)胞系或者酶消化液（膠原酶），在分發(fā)之前有必要通過(guò)輕柔的離心（125g，5min）去除酶消化液。
細(xì)胞的計(jì)數(shù)或等分：

為了得到細(xì)胞的生長(zhǎng)速率或者按已知的濃度接種細(xì)胞，就需要對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，我們可以使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器或電子細(xì)胞計(jì)數(shù)器。血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的優(yōu)點(diǎn)是比較便宜，而且可以同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞的活率。輕輕混勻細(xì)胞懸液，取出0.5ml進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。向其中加入0.5ml活細(xì)胞染色液如臺(tái)盼蘭（trypan blue）或赤蘚紅B（erythrosin B），充分混勻，取出部分樣品，小心加入干凈的血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中。
計(jì)算細(xì)胞懸液中細(xì)胞的實(shí)際濃度（每毫升懸液中的細(xì)胞數(shù)）以及細(xì)胞的活率，然后計(jì)算為了達(dá)到合適的傳代密度需要使用的懸液體積。除了細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞懸液也經(jīng)常按傳代培養(yǎng)瓶的數(shù)量進(jìn)行等分。例如，1：2傳代意味著將一個(gè)培養(yǎng)瓶中得到的細(xì)胞懸液等分至兩個(gè)新的等培養(yǎng)面積的培養(yǎng)瓶中，該法適用于細(xì)胞的精確密度不是非常重要時(shí)的常規(guī)細(xì)胞傳代。
細(xì)胞的接種：

分發(fā)合適的細(xì)胞懸液至事先準(zhǔn)備好的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中（將高濃度的細(xì)胞懸液直接加入空的培養(yǎng)瓶會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的不均勻貼壁和生長(zhǎng)）。對(duì)于生長(zhǎng)快速的細(xì)胞，接種的密度可以低一些。然而，有些細(xì)胞在低于一定接種密度時(shí)，生長(zhǎng)的不好。但多數(shù)細(xì)胞在起始密度為10³-10⁴細(xì)胞每平方厘米或更高（每個(gè)75cm²培養(yǎng)瓶接種7.5×10⁴到7.5×10⁵個(gè)細(xì)胞）時(shí)都可以生長(zhǎng)的很好。

細(xì)胞的培養(yǎng)：

將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱，大多數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在35度到37度的恒溫下生長(zhǎng)的最好。除了維持穩(wěn)定的溫度，對(duì)于非封閉的培養(yǎng)容器如Dish或多孔板，培養(yǎng)箱還需要維持較高的濕度和CO₂水平。高濕度可以防止培養(yǎng)容器中的液體揮發(fā)損失，進(jìn)而導(dǎo)致的培養(yǎng)液濃縮引起的高滲透壓。
當(dāng)培養(yǎng)液使用的是含適量的NaHCO₃的緩沖系統(tǒng)時(shí)，提升CO₂的水平（通常為5%-10%）可以使培養(yǎng)液維持在一個(gè)合適的pH范圍（7.0-7.6）。為了使此類緩沖系統(tǒng)可以正常的工作，需要使用非密封（瓶蓋旋松）或氣體可透過(guò)的培養(yǎng)瓶以保證正常的氣體交換。如果沒(méi)有可用的CO₂，有一種緩沖系統(tǒng)可以在封閉的培養(yǎng)容器中維持培養(yǎng)液處在合適的pH范圍。
傳代次日進(jìn)行鏡下觀察，確保細(xì)胞已經(jīng)重新貼壁并活躍增殖。培養(yǎng)期間按要求進(jìn)行換液，對(duì)于大多數(shù)活躍增殖的細(xì)胞來(lái)說(shuō)，通常一周需要換液2-3次。

啟維益成代理的相關(guān)產(chǎn)品：
胰蛋白酶：http:///cn/br/Cytokines%20and%20proteins/03/P141442.htm        

赤蘚紅erythrosin   http:///cn/br/bm/01/P266235.htm