雙重免疫組化是科研中的較好的一種免疫組化方法，其原理就是根據(jù)陽性表達部位和陽性表達區(qū)域不同所建立的一種直觀的多色定位的染色方法。其標記的對象是兩種或兩種以上的細胞部位。主要標記部位如下：

    1.膜+漿型

    2.膜+核型

    3.漿+核型

    切不可膜+膜，核+核，以免影響效果和顏色重疊。由于HRP和AEC顯色系統(tǒng)的肉眼鏡下顏色不同，所以直接抗原定位表達就非常直觀了。

    雙重免疫組化的步驟：

    1、切片脫蠟至水

    2、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶（198毫升甲醇或水+2毫升30% H2O2）室 溫20分鐘。

    3、pH7.2緩沖液洗三次。

    4、胰蛋白酶消化37 ℃，30分鐘。（或按說明書要求：放入抗原修復液內(nèi)微波修復20分鐘、或電爐加熱30分鐘、或高壓鍋加帽出氣后3分鐘，快速冷卻；或不處理）

    6、滴加正常血清37 ℃，30分鐘。（可不用）

    7、擦去多余血清，加一抗37 ℃，30分鐘。

    8、pH7.2緩沖液洗三次。

    9、滴加生物素化二抗，37 ℃，30分鐘。

    10、pH7.2緩沖液洗三次。

    11、滴加ABC或S-P復合物，37 ℃，45分鐘。

    12、pH7.2緩沖液洗三次。

    13、DAB或（BCIP/NBT紫藍色）顯色3~10分鐘。

    14、pH7.2緩沖液洗三次。

    15、雙標阻斷液，10分鐘（可不用）

    16、滴加正常血清37 ℃，30分鐘。（可不用）

    17、擦去多余血清，加第二種一抗37 ℃，30分鐘。

    18、pH7.2緩沖液洗三次。

    19、滴加生物素化二抗，37 ℃，30分鐘。

    20、滴加堿性磷酸酶復合物，37 ℃，30分鐘。

    21、AEC顯色

    22、水洗

    23、蘇木素淡染，藍化，脫水，透明，封固

    注意事項：

    1.玻片的處理 雙重免疫組化步驟繁多，兩次熱修復對玻片涂膠要求較 高，以免脫片。

    2.由于兩種顯色系統(tǒng)顏色可能產(chǎn)生重疊，所以應(yīng)該先讓不容易顯的放在前面，容易出色的放在后面。無特別說明，還是先出HRP系統(tǒng)，后AEC系統(tǒng)。

    3.雙重染色要有目的性，不可盲目雙重染色造成結(jié)果無說服意義。

    雙重染色的應(yīng)用：

    1.用于區(qū)分常規(guī)HE染色下教難辨別的部位，例如，脈管系統(tǒng)中淋巴管道和 血管管腔無法肉眼區(qū)分。

    2.惡性腫瘤的擴散顯示。惡性腫瘤細胞的浸潤在正常黏膜下呈慢性吞噬，如果對上皮和腫瘤細胞同時標記，可以更直接的觀察滲透情況。

    3.不同細胞在同一區(qū)域的分布情況。

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