細(xì)胞技術(shù)專題：大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)可以：（1）應(yīng)用于血腦屏障的研究；（2）腦血管疾病的病理生理及分子生物學(xué)研究；（3）新藥篩選；（4）腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞生理生化及藥理學(xué)研究。
實(shí)驗(yàn)方法
- 酶消化法
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | 丁香園站友參考文獻(xiàn)采用以大腦皮質(zhì)為材料、酶消化及梯度離心分離腦微血管段并進(jìn)行原代培養(yǎng),，成功地摸索出大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)的方法，并獲得純度較高的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 |
SD大鼠 |
| 試劑、試劑盒 |
纖連蛋白 Ⅳ型膠原 明膠 肝素鈉 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 青霉素 鏈霉素 NaHCO3 牛血清白蛋白 鼠尾膠 葡聚糖 DNA酶I D-Hanks'液 II型膠原酶 |
| 儀器、耗材 |
低溫離心機(jī) 離心管 移液槍 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 |
一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備
1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
每次實(shí)驗(yàn)采用10只2-3周齡SD大鼠，雌雄均可，體重40~60 g。
2. 試劑 纖連蛋白(fibronectin)、Ⅳ型膠原、鼠尾膠、葡聚糖(dextran，分子量100~200 kDa)和DNA酶I(DNase I)購(gòu)自Sigma公司；D-Hanks'液、10×PBS按配方自制；II型膠原酶購(gòu)自Worthington公司；明膠、牛血清白蛋白(BSA)、HEPES購(gòu)自Amresco公司；Percoll 購(gòu)自Amersham Biosciences；DMEM(高糖)購(gòu)自GIBCO/BRL公司；肝素鈉、NaHCO3購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上�；瘜W(xué)試劑公司；青、鏈霉素購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自PAA Laboratories；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，膠原酶/分散酶(collagenase/dispase)購(gòu)自Roche公司。
3. 儀器
低溫離心機(jī)(Centrifuge 5810 R，購(gòu)自Eppendorf；Himac CR 22F，購(gòu)自Hitachi)。
4. 試劑配制
（1）1 mg/ml鼠尾膠(用0.2%乙酸配制)，1%明膠(用D-Hanks'液配制)，1%II型膠原酶(用DMEM配制，用時(shí)稀釋成0.1%的濃度)，1%膠原酶/分散酶(用DMEM配制，用時(shí)稀釋成0.1%)，15%葡聚糖(用PBS配制)，20% BSA(用DMEM配制，調(diào)pH值至7.4后用0.45 μm濾膜過(guò)濾除菌，較難過(guò)濾)，DNase I(用冷PBS配制成2 U/μl)，以上試劑經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌后分裝保存于-20℃。
（2）50%Percoll(配12 ml，需6 ml Percoll原液，0.67 ml 10×PBS，0.4 ml FBS，4.93 ml PBS)；DMEM培養(yǎng)液(含4000 mg/L D-葡萄糖，4 mmol/L L-谷氨酰胺，添加3.7 g/L NaHCO3，20 mmol/L HEPES，肝素鈉 100 mg/L，青霉素 100 U/ml，鏈霉素 100 μg/ml)，pH值調(diào)至7.4，過(guò)濾除菌后分裝保存于4 ℃，用時(shí)加入20% FBS及1 ng/ml bFGF。 二、培養(yǎng)皿預(yù)處理
1. 涂布3種不同的基質(zhì)，培養(yǎng)前一天加入1 ml 1%明膠于35 mm塑料培養(yǎng)皿，置于37 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜，接種前用D-Hanks'液漂洗2次。
2. 接種前4 h，加入鼠尾膠6~10 μg/cm2，在密閉的器皿里用氨氣熏5~10 min后，置于室溫1~2 h晾干后，用D-Hanks'液漂洗2次。 3. 50 μl 0.1%纖連蛋白、50 μl 1 mg/ml Ⅳ 型膠原和400 μl雙蒸水混合后，加入到每個(gè)培養(yǎng)皿中涂布均勻后吸出，可涂布10個(gè)培養(yǎng)皿，置于37 ℃培養(yǎng)箱1~2 h晾干后，用D-Hanks'液漂洗2次。 三、 腦微血管段的分離與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)
1. 大鼠頸椎脫臼處死后浸泡于75%乙醇中消毒3~5 min后斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開(kāi)顱腔后取出全腦置于盛有冷D-Hanks'液的玻璃培養(yǎng)皿中解剖去除小腦、間腦(包括海馬)。
2. 隨后將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動(dòng)以吸除軟腦膜及腦膜大血管后置于新的含冷D-Hanks'液玻璃培養(yǎng)皿中，用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質(zhì)。 3. 用D-Hanks'液漂洗3次后，加入1 ml DMEM培養(yǎng)液，用虹膜剪將其剪碎成1 mm3大小，加入0.1%Ⅱ型膠原酶(含30 U/ml DNase I，1 ml/大腦)混勻后37 ℃水浴消化1.5 h。 4. 離心(1 000 rpm，8 min，室溫)，去上清液，加入20% BSA懸浮混勻后離心(1000 g，20 min，4 ℃)或加入15%葡聚糖懸浮混勻后離心(4 000 rpm，20 min，4 ℃)，去除中上層神經(jīng)組織及大血管，保留底部沉淀。 5. 加入2 ml 0.1%膠原酶/分散酶(含20 U/ml DNase I)懸浮混勻后37 ℃水浴消化1 h，離心(1 000 rpm，8 min，室溫)，去上清液，加入2 ml DMEM培養(yǎng)液懸浮后鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12 ml 50% Percoll(25 000 g，60 min，4 ℃)。 6. 離心(1 000 g，10 min，4 ℃)，靠近底部的紅細(xì)胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后用DMEM漂洗兩次(離心1 000 rpm，5 min，室溫)，去上清液。 7. 加入DMEM完全培養(yǎng)液(含20% FBS，100 μg/ml肝素鈉)懸浮后接種于涂布基質(zhì)的35 mm一次性塑料培養(yǎng)皿(1.5 ml/培養(yǎng)皿，可接種1個(gè)培養(yǎng)皿/大腦)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，12~24 h后換液，并加入1 ng/ml bFGF，隨后隔天換液。 四、鑒定方法
形態(tài)學(xué)、Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組織化學(xué)檢測(cè)。
五、 結(jié)果
1. 細(xì)胞形態(tài)觀察
接種當(dāng)時(shí)可見(jiàn)由圓形的內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的呈單枝狀或分枝狀的腦微血管段，并可見(jiàn)散在的單細(xì)胞及組織碎片(見(jiàn)圖1-1)；培養(yǎng)12~24 h后可見(jiàn)培養(yǎng)的細(xì)胞從貼壁的微血管段周圍長(zhǎng)出，細(xì)胞呈短梭形，區(qū)域性單層生長(zhǎng)，經(jīng)換液后微血管段的殘余部分不斷減少，成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞等雜細(xì)胞含量較少；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，內(nèi)皮細(xì)胞不斷增殖，可見(jiàn)"漩渦"分布，大約5~7天細(xì)胞達(dá)到融合，短梭形的內(nèi)皮細(xì)胞占90%以上，但可見(jiàn)少量周細(xì)胞等雜細(xì)胞生長(zhǎng)于內(nèi)皮細(xì)胞單層表面或細(xì)胞克隆間隙(結(jié)果未顯示)。細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程見(jiàn)圖1，細(xì)胞接種于纖連蛋白/Ⅳ型膠原涂布的培養(yǎng)皿。
 2. 涂布不同基質(zhì)的細(xì)胞生長(zhǎng)情況
明膠及鼠尾膠涂布的培養(yǎng)皿微血管段貼壁時(shí)間較長(zhǎng)，6 h時(shí)可見(jiàn)少量微血管段貼壁但無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)出，12~24 h可見(jiàn)一些內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)出，24 h后腦微血管段完全貼壁并有較多的內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)出，兩者無(wú)明顯差異(見(jiàn)圖2-1~4)；纖連蛋白/Ⅳ型膠原涂布的培養(yǎng)皿培養(yǎng)后6 h即可見(jiàn)微血管段貼壁并有一些內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)出，12~24 h內(nèi)基本完全貼壁并有較多的內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)出(見(jiàn)圖2-5,6)。
 3. 免疫組化鑒定
Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化檢測(cè)可見(jiàn)培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿及核周有棕黃色著色，胞核呈空泡狀結(jié)構(gòu)；對(duì)照染色為陰性。
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| 其他 |
一、實(shí)驗(yàn)討論 我們采用兩次酶消化、梯度離心分離得到腦微血管段，探索各種不同的培養(yǎng)條件，成功地進(jìn)行了較純的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)，內(nèi)皮細(xì)胞純度可達(dá)90%以上，而且細(xì)胞得率較高，10只動(dòng)物可培養(yǎng)8~10個(gè)35 mm一次性塑料培養(yǎng)皿，培養(yǎng)面積大約80~100 cm2，與國(guó)內(nèi)的一些方法[3~5]相比，細(xì)胞得率有明顯的提高。
由于新生鼠易于混有較多的雜細(xì)胞且大腦較小以及哺乳期大鼠優(yōu)于超過(guò)1月齡的大鼠[9]，我們采用2~3- 12 - 丁香園細(xì)胞技術(shù)討論版電子文集 大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)周齡哺乳期的SD大鼠作為培養(yǎng)材料。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的關(guān)鍵是首先分離獲得純度較高且活力好的腦微血管段。在解剖過(guò)程中仔細(xì)去除軟腦膜、大血管及大腦白質(zhì)收集大腦皮質(zhì)，可減少成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)于提高內(nèi)皮細(xì)胞的純度具有重要意義。由于膠原酶對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷較小，我們采用0.1%Ⅱ型膠原酶消化剪碎后的大腦皮質(zhì)分散組織，同組織勻漿法[3,10]相比，酶消化法可避免組織勻漿對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，從而有利于提高細(xì)胞的活力。經(jīng)膠原酶消化后采用20% BSA或15%葡聚糖離心可分離腦微血管段與神經(jīng)組織及大血管，得到底層的腦微血管段，這種方法被廣泛應(yīng)用于腦微血管段的分離[5~9,11,12]，我們發(fā)現(xiàn)20% BSA較15%葡聚糖而言，其分離獲得的腦微血管段數(shù)量更多，而且腦微血管段狀態(tài)更好更易貼壁生長(zhǎng)。由于周細(xì)胞是腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)中最常見(jiàn)的雜細(xì)胞，它會(huì)明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)[7]，因此原代培養(yǎng)中應(yīng)盡量減少周細(xì)胞的數(shù)量，我們采用兩次酶消化方法[7]，控制兩次酶消化的時(shí)間，用0.1%膠原酶/消化酶分散出內(nèi)皮細(xì)胞外圍的周細(xì)胞，最后采用一定濃度的連續(xù)梯度的Percoll分離以去除周細(xì)胞和紅細(xì)胞得到較純的腦微血管段。在酶消化過(guò)程中加入適量的DNA酶可分散消化過(guò)程中釋放的DNA所引起的微血管段凝結(jié)塊，有利于增加微血管段的得率。對(duì)于Percoll離心，我們嘗試了3個(gè)濃度(33%、45%及50%)后發(fā)現(xiàn)，濃度越大，腦微血管段離靠近離心管底的紅細(xì)胞及周細(xì)胞越遠(yuǎn)，分離效果也越好，因此采用50% Percoll效果最好，并且最好采用水平轉(zhuǎn)頭的低溫離心機(jī)以提高離心效果。內(nèi)皮細(xì)胞純化的其他方法有機(jī)械刮除法、克隆培養(yǎng)法、FACS分類法[13]、Thy1.1免疫反應(yīng)殺傷法[7,14]、采用血漿來(lái)源的胎牛血清[8]、磁珠結(jié)合法[10]等，但是我們發(fā)現(xiàn)機(jī)械刮除法和克隆培養(yǎng)法并不適合大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的純化，因?yàn)樵鷥?nèi)皮細(xì)胞傳代后狀態(tài)不佳且易被雜細(xì)胞所抑制[7]，而后面幾種方法比較昂貴不予推薦；血漿來(lái)源的胎牛血清不含PDGF，不促進(jìn)雜細(xì)胞的生長(zhǎng)，但是其較昂貴，可選擇胎牛血清用于原代培養(yǎng)。
腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)需要涂布明膠、鼠尾膠、纖連蛋白等基質(zhì)以利于腦微血管段貼壁和內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。我們嘗試不同基質(zhì)后發(fā)現(xiàn)其對(duì)腦微血管段的貼壁和內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)作用不同，纖連蛋白/IV型膠原優(yōu)于鼠尾膠，而鼠尾膠比明膠好，而且接種密度的要求前者比后兩者要低，后兩者需要達(dá)到一定密度才有利于腦微血管段貼壁。另外我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞不易生長(zhǎng)于玻片上，而較易生長(zhǎng)于塑料培養(yǎng)皿上，這與文獻(xiàn)報(bào)道基本相符[8,14]。內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)需要添加內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖抑制雜細(xì)胞的生長(zhǎng)，我們采用bFGF可有效促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)添加100 μg/ml肝素協(xié)同bFGF的作用并可抑制平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)[9]。同時(shí)為了保證內(nèi)皮細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)，并去除腦微血管段的殘余碎片，我們采用20% FBS的血清濃度并隔天換液。
我們培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞呈短梭形，區(qū)域性單層生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)及內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，可見(jiàn)"漩渦狀"分布，約5~7天后，各區(qū)域之間可逐漸融合，其形態(tài)和生長(zhǎng)特點(diǎn)與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道相似[6~9,11,12]。根據(jù)內(nèi)皮細(xì)胞的短梭形的形態(tài)特點(diǎn)、Ⅷ因子相關(guān)抗原表達(dá)陽(yáng)性可鑒定我們所培養(yǎng)的細(xì)胞確為腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞[3,5,8]。
我們的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的建立，對(duì)于研究腦內(nèi)皮的生理、生化及藥理研究是一個(gè)較好的工具，同時(shí)可與星型膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)用于構(gòu)建血腦屏障模型[1]。相信隨著技術(shù)方法的不斷改進(jìn)，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的模型將逐漸接近于其在體特征，并被廣泛應(yīng)用于相關(guān)研究[1]。
參考文獻(xiàn)
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