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蛋白質(zhì)技術(shù)專題:谷胱甘肽的測(cè)定實(shí)驗(yàn)

瀏覽次數(shù):1482 發(fā)布日期:2013-12-23  來(lái)源:上海北諾生物科技有限公司

谷胱甘肽(glutathiose,r-glutamyl cysteingl +glycine,GSH)是一種含γ-酰胺鍵和巰基的三肽,由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成。存在于幾乎身體的每一個(gè)細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)方法
雙抗夾心ELISA法
免疫組織法
實(shí)驗(yàn)方法原理 先將康體包被于反應(yīng)板上,加入待測(cè)抗原,然后再加入酶標(biāo)康體,顯色后即可測(cè)得抗原含量。 
實(shí)驗(yàn)材料 抗體 
試劑、試劑盒 碳酸鹽緩沖液 Na2CO3 磷酸鹽緩沖液 NaCl KCl TMB 二甲基亞砜 牛血清蛋白 
儀器、耗材 酶標(biāo)儀 培養(yǎng)箱 
實(shí)驗(yàn)步驟 一、材料準(zhǔn)備

1.  包被液:0.05 mol/l(pH9.6)碳酸鹽緩沖液:Na2CO3 0.159 g,NaHCO3 0.294 g,用蒸餾水溶解后,定容至100 ml。

2.  PBS-T洗滌液:0.01mol/ pH7.4磷酸鹽-氯化鈉緩沖液:NaCl 8.0 g,KH2PO4 0.2 g,Na2HPO4·12H2O 2.9 g,KCl 0.2 g,吐溫-20 0.5 ml,用蒸餾水溶解后,定容至1000 ml。

3.  底物溶液3,3’,5,5‘-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)貯存液及應(yīng)用液:

(1)0.1 mol/l pH6.8 PBS:Na2HPO4·12H2O 1.09 g,NaH2PO4·H2O 6.05 g,蒸餾水溶解后定容至500 ml,4℃保存?zhèn)溆谩?/FONT>

(2)TMB貯備液:TMB 60 mg 溶于10 ml 二甲基亞砜(DMSO)中4℃保存?zhèn)溆谩?/FONT>

(3)TMB應(yīng)用液:臨用前取0.1 mol/l pH6.0 PBS 10 ml,TMB貯備液100 ul,30%H2O2 15 ul 混勻即可。

二、實(shí)驗(yàn)步驟

1.  抗體包被

(1)抗體用包被液稀釋至20 ug/ml,加入聚苯乙烯反應(yīng)板中每孔100 ul,加蓋后放4℃過(guò)夜。

(2)傾去孔內(nèi)液體,加入洗滌液后靜置3 min,傾盡洗滌液,重復(fù)洗滌3次。

(3)將反應(yīng)板口在吸水紙上,以除盡液體。

2.  封閉:每孔加入200 ul封閉液,37℃孵育60 min,然后洗滌3次。

3.  加入待測(cè)血清,37℃溫育1~2 h,洗滌3次。用稀釋液作對(duì)照孔,標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備是用不容稀釋度的純GST-π。

4.  加酶標(biāo)抗體:按要求稀釋抗GST-π-IgG-HRP,每孔100 ul,37℃溫育1 h,然后洗滌5次,扣在吸水紙上吸干水分。

5.  顯色:加入TMB應(yīng)用液,置室溫反應(yīng)15~30 min,加入50 ul 2 mol/l H2SO4,穩(wěn)定3~5 min,即可比色。

6.  比色:用酶標(biāo)儀,以PBS-T孔為對(duì)照,波長(zhǎng)450 nm,測(cè)各孔光吸收度(A),查標(biāo)準(zhǔn)曲線,即可測(cè)得GST-π含量。

來(lái)源:上海北諾生物科技有限公司
聯(lián)系電話:021-57730393,15800960770
E-mail:beinuobio@163.com

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