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蛋白質(zhì)技術(shù)專(zhuān)題：蛋白質(zhì)的提取及粗分離實(shí)驗(yàn)

瀏覽次數(shù)：1512　發(fā)布日期：2013-12-11　來(lái)源：上海北諾生物科技有限公司

分離純化蛋白質(zhì)，首先要從原材料中提取目的蛋白，然后通過(guò)粗分離的方法除去大量雜質(zhì)，最后進(jìn)行精細(xì)分離，得到目的蛋白。本實(shí)驗(yàn)以新型基因重組人TNF為例闡明重組蛋白TNF的提取及初步分離。

實(shí)驗(yàn)方法

硫酸銨鹽析法

實(shí)驗(yàn)方法原理	分離純化蛋白質(zhì)，首先要從原材料中提取目的蛋白，然后通過(guò)粗分離的方法除去大量雜質(zhì)，最后進(jìn)行精細(xì)分離，得到目的蛋白。本實(shí)驗(yàn)以新型基因重組人TNF為例闡明重組蛋白TNF的提取及初步分離。 TNF的提取是將發(fā)酵菌體裂解，在一定的條件和溶液中，使被提取的TNF充分釋放出來(lái)，經(jīng)離心收集混合液中提取的TNF成份的過(guò)程。含有TNF的提取溶液中，含有大量的雜蛋白，由于蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度主要取決于蛋白質(zhì)分子表面的水分子數(shù)目，即蛋白質(zhì)表面親水基團(tuán)與水分子形成水化膜的程度和帶電荷的情況，當(dāng)中性鹽如硫酸銨等加入蛋白質(zhì)溶液時(shí)，由于中性鹽對(duì)水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)分子周?chē)乃p弱或消失，蛋白質(zhì)溶解度降低，同時(shí)由于中性鹽的加入，蛋白質(zhì)溶液的離子強(qiáng)度發(fā)生了改變，蛋白質(zhì)表面電荷被大量中和，更加導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間互相聚集而發(fā)生沉淀。不同的蛋白質(zhì)由于其帶電性，親水性等性質(zhì)的不同，會(huì)在不同濃度的鹽中形成沉淀。依此原理可對(duì)混合蛋白質(zhì)進(jìn)行粗分離。該實(shí)驗(yàn)中利用硫酸銨鹽析除去大部分雜蛋白從而使TNF得到初步純化。
實(shí)驗(yàn)材料	新型基因重組人TNF
試劑、試劑盒	蔗糖 TRIS 鹽酸乙二氨四乙酸二鈉氫氧化鈉 STE溶液 Dnase I 脫氧膽酸鈉溶液
儀器、耗材	透析袋攪拌棒滅菌鍋電子天平燒杯稱(chēng)量紙藥匙量筒燒杯制冰機(jī)
實(shí)驗(yàn)步驟	一、試劑配制 1. STE（25%蔗糖 10 mmol/L Tris-HCl pH 8.5 1 mmol/L EDTA）蔗糖 250 g 1 mol/L Tris.HCL 10 ml 0.5 mol/L EDTA 2 ml，加水至1 000 ml 115℃，20 min高壓滅菌 2. 1mol/L MgCl₂ 取 MgCl₂ 203.30 g，加水至1 000 ml 3. Tris-HCL pH8.5 取Tris 121.14 g 用HCL調(diào)pH至8.5，加水至1 000 ml （12 mol/L HCL約30 ml） 4. 0.5 mol/L EDTA pH8.5 乙二氨四乙酸二鈉 186.12 g NaOH 20 g，加水至1 000 ml 121℃，20 min高壓滅菌二、操作步驟 1. 稱(chēng)取菌體重量，按5~10 ml/g菌體加入STE溶液，攪拌至菌體完全懸浮。 2. 按0.5~1 mg/g菌體加入用STE溶液新鮮配制的溶菌酶溶液，用玻璃棒用力攪勻后于4℃環(huán)境中放置20 min。此時(shí)菌液呈粘稠狀。 3. 按10 mg/g菌體加入用STE溶液新鮮配制的脫氧膽酸鈉（DOC）溶液，用力攪勻。 4. 加入5~10 ml 1 mol/L MgCl₂溶液，攪勻后加入約40 μl Dnase I（25 mg/ml）充分?jǐn)嚢柚辆鹤兿　?BR> 5. 15 000 rpm，4℃離心30 min。 6. 取離心上清，精確量取其體積，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，倒入置于冰浴的燒杯中，邊攪拌邊緩慢加入固體硫酸銨使其達(dá)到50%飽和度。待固體硫酸銨安全溶解后，靜置于0℃環(huán)境中30 min。 7. 離心，15 000 rpm，4℃，30 min。取離心上清，量其體積，測(cè)定蛋白濃度。 8. 將離心上清裝入透析袋，4℃攪拌在pH8.5 20 mmol/L Tris-Hcl，1 mmol/L EDTA溶液中透析。加入硫酸銨不論是固體硫酸銨，還是加入飽和硫酸銨溶液，加入時(shí)應(yīng)邊加入邊攪拌，特別注意① 加入硫酸銨要慢，因?yàn)樘鞎?huì)引起蛋白質(zhì)發(fā)生共沉淀，加入固體硫酸銨時(shí)事先要將硫酸銨研磨成粉末，加入飽和硫酸銨溶液時(shí)要一滴一滴地加入；② 攪拌要慢，攪拌劇烈，蛋白質(zhì)溶液容

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