固相肽合成（solid phase peptide synthesis, SPPS）技術(shù)是現(xiàn)代蛋白質(zhì)化學(xué)的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，也是對(duì)現(xiàn)代分子生物學(xué)和基因工程研究具有重大影響和重要意義的技術(shù)。它的基本過程為：1、偶聯(lián)保護(hù)氨基，即將第一個(gè)保護(hù)氨基以共價(jià)鍵偶聯(lián)外固相載體上（在合成過程中始終不能脫落）。2、脫保護(hù)，在側(cè)鍵基團(tuán)保持穩(wěn)定條件下脫去氨基上的保護(hù)，暴露出自由氨基，例如脫去Fmoc。3、偶聯(lián)，將下一個(gè)已活化的氨基酸與結(jié)合于固相的前一個(gè)氨基酸縮合形成肽鍵。4、肽鍵延長，反復(fù)進(jìn)行脫保護(hù)與偶聯(lián)兩步使肽鍵延長到設(shè)計(jì)長度。5、切割，將合成的肽由固相載體上切割下來并脫去側(cè)鏈保護(hù)。6、純化，切割后的肽進(jìn)行純化、鑒定。下面以合成的huBPP為例，簡介在Pioneer上的合成切割及純化過程：

 

Pioneer肽合成儀、氬氣，純度99.99%、二甲基甲酰胺（DMF）、哌啶、HATU、二異丙基乙胺、 甲醇、TFA（三氟乙酸）、合成需要的側(cè)鍵保護(hù)氨基酸、樹脂 Fmoc-PAL-PEG-PS

 

注：Fmoc-芴甲氧羰基（Fluoreny lmethyl oxoxy carbonyl）

PEG-聚乙二醇

PAL-肽酰胺接頭（peptide amide linker）

PS-樹脂（polystyrene）

 

 

準(zhǔn)備氣體→沖洗管路→檢查管路→合成準(zhǔn)備（裝試劑、輸入序列等）→合成→合成結(jié)束

 

1．開機(jī)及調(diào)節(jié)氣壓、檢查是否漏氣

1）依次打開電源開關(guān)、UPS開關(guān)、計(jì)算機(jī)

2）安裝所有的瓶子（空）

3）檢查氦氣罐內(nèi)氣體量（保證剩余量>200PSI），輸出壓力為20PSI

4）打開合成儀電源，等待儀器進(jìn)入主菜單

5）按Tools-Ding-I/O1

6）打開氣體閥Gas Valve(4) ON回主菜單

7）按Manul-Fluidie System 1 -Wash

8）調(diào)節(jié)壓力到6±0.2PSI，回主菜單

9）按Tools-Diag-Leak-Start，回主菜單
 

2．沖洗系統(tǒng)管道

1）按Tools-Bottle

2）在Wash瓶內(nèi)裝入2L DMF

3）主菜單中按Prime-Prime Individual，回主菜單

4）按Prime-More-Start up/Shut Down-Column 1

5）對(duì)Column2重復(fù)上一步操作

6）回主菜單
 

3．檢查每個(gè)瓶子的管道

1）按Tools-Bottle

2）在所有瓶內(nèi)裝入50mL DMF，回主菜單

3）按Prime-Prime Lines-Column1-OK，回主菜單

4）按Manual-Fluidic System1(2或Both，視情況而定) -Wash-Fluid  Destination至Wast出現(xiàn)-YES

5）打開Wash瓶，抽出管道-Start，檢查兩個(gè)管道是否通暢-Cancel

6）重復(fù)以上各步，分別檢查各個(gè)管道是否通暢�；刂鞑藛�

7）對(duì)Column2同樣操作，回主菜單
 

4．合成準(zhǔn)備

1）按Tools-Bottle

2）卸下各個(gè)瓶子，裝入用于合成的試劑，回主菜單

3）按Manu1-Transport System1(2或Both) -End

4）在第1至n位中放入氨基酸（放置順序與合成序列相反），第n+2位放一個(gè)空管

5）在Transport System視窗中循環(huán)按Adv-Align檢查每個(gè)位置是否有氨基酸管同時(shí)觀察探針運(yùn)動(dòng)是否正常

6）按Prime-2-System Prep-Column 1-OK，cancel

7）不要接柱子，對(duì)Column2同樣操作

8）裝柱并上柱

9）Prime4-Column Prep-Column 1-OK, 對(duì)Column2同樣操作

10）按Tools-Config-Def-OK，回主菜單

11）按Seq-Edit-Ins輸入要合成的序列

12）Seq Menu-Run-Column 1(2或Both) 必要修改參數(shù)-OK

13）注：序列輸入以及參數(shù)的設(shè)置也可以在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行。
合成

從主菜單按Strt1、Strt2，開始合成，直到結(jié)束。
 

小心卸一柱子，倒出肽合成樹脂。若切割時(shí)，可按切割程序進(jìn)入，否則將合成肽樹脂冷凍干燥后保存。
 

1,，資源報(bào)告；

2，脫保護(hù)圖譜；

3，合成過程UV檢測圖譜

  a，脫N端的Fmoc紫外吸收；

  b，去Fmoc，洗柱紫外吸收；

  c，溶解待合成接上去氨基酸的紫外吸收；

  d，偶聯(lián)氨基酸到柱子上；

  e，洗探針的紫外吸收；

  f，如果使用延時(shí)合成時(shí)對(duì)檢測器沖洗的紫外吸收；

  g，洗滌柱子的紫外吸收。

 

切割（Cleavage）屬于肽合成的后處理部分，是指將已合成的肽從載體（樹脂）上切割下來。有人認(rèn)為也包括脫去側(cè)鏈保護(hù)。切割及去保護(hù)是合成中最重要步驟。如果試劑和反應(yīng)條件選擇不當(dāng)，產(chǎn)物會(huì)發(fā)生不可逆的修飾而被破壞，因此在切割時(shí)應(yīng)注意以下幾個(gè)問題：1、選擇合適的切割及脫保護(hù)試劑，根據(jù)合成肽氨基酸的不同而選擇；2、選擇合適的試劑濃度、反應(yīng)時(shí)間、溫度等條件；3、氨基酸側(cè)鏈的保護(hù)，在切割時(shí)，切割試劑或切割產(chǎn)物可能對(duì)一些對(duì)其敏感氨基酸側(cè)鏈造成破壞或修飾，因此，反應(yīng)時(shí)要選擇合適試劑和條件，必要時(shí)，對(duì)敏感側(cè)鏈進(jìn)行保護(hù)，使其遭到最小程度的破壞。

 

試劑配方：TFA/phenyl/water/TIPS=88/5/5/2

條件：
用量   0.5g介質(zhì)/5ml TFA液

溫度   冰浴中

時(shí)間   2h
 

（二）切割操作流程
 

 

1，茚三酮定性反應(yīng)，檢測介質(zhì)上huBPP切割是否完全

取4支試管，分別加入①未切割介質(zhì)；②合成前介質(zhì)；③已切割介質(zhì)；④甘氨酸少許，分別加入0.5ml-1ml酸水（<pH3），再加入少許茚三酮，水浴加熱，觀察顏色變化。氨基酸與茚三酮反應(yīng)呈紫色。

2，HPLC法：檢測切割后肽的純度

HPLC條件：

儀器：Beckman gold system

色譜柱：DiamonsilTM  C18 5μl，250×4.6mm，迪馬公司產(chǎn)品

流動(dòng)相：A: 0.1% TFA

                B: 0.1% TFA-CH3CN

洗脫梯度：B: 0~100%  20min

流速：1ml/min

檢測波長：245nm

樣品準(zhǔn)備：取切割后水相液體過0.45μl水性膜，取20μl上樣。

結(jié)果分析：觀察與對(duì)照品的保留時(shí)間，峰面積百分比等參數(shù)。

 

在肽的合成和切割中會(huì)產(chǎn)生一不完全肽、反應(yīng)副產(chǎn)物、殘留試劑等，有必要對(duì)肽進(jìn)行純化。

有關(guān)肽的純化和蛋白質(zhì)純化、鑒定有許多相似之處，如均可用色譜純化，但也在它的特殊性，如分子量太小，不易透析除鹽，一般不易用常規(guī)SDS-PAGE鑒定等，所以，它的純化、鑒定應(yīng)根據(jù)肽的特性來設(shè)計(jì)。HuBPP水溶性好，可以用離子交換色譜如Q-Sepharose FF純化，平衡液pH選在7.0即可。也可以用反相柱純化。下面介紹huBPP的反相純化方法。

 

儀器：Waters 650半制備色譜儀

色譜柱 Prep Park 25×10 Cartridge

內(nèi)柱：Delta-PakTM  C18  100A 15μ

乙腈

 

樣品準(zhǔn)備

將切割后水相離心，或過濾除雜，備用

平衡柱子，用H2O平衡柱子，流速3ml/min，到基線平穩(wěn)

上樣，注入5ml樣品

洗脫：B液：0~60%  30min

分部收集洗脫峰
 

純度鑒定：將各峰分別上HPLC反相柱分析，條件見高效液相色譜實(shí)驗(yàn)中反相色譜部分。

含量測定及計(jì)算收率：用Lorry's 法測定切割、純化各步驟中的肽含量度計(jì)算收率。