蛋白質(zhì)技術(shù)專題：高效液相色譜之高效反相液相色譜
反相色譜（reversed phasc chromatography, RPC）是基于溶質(zhì)、極性流動相和非極性固定相表面間的疏水效應(yīng)建立的一種色譜模式，任何一種有機(jī)分子的結(jié)構(gòu)中都有非極性的疏水部分，這部分越大，一般保留值越高，在高效液相色譜中這是應(yīng)用面最廣的一種分離模式，在生物大分子的反相液相色譜條件下，流動相多采用酸性的、低離子強(qiáng)度的水溶液，并加一定比例的能與水互溶的異丙醇、乙腈或甲醇等有機(jī)改性劑，大量使用的填料為孔徑在30納米以上的硅膠烷基鍵合相，除此之外，也有少量高聚物微球。實驗表明，烷基鏈長對蛋白質(zhì)的反相保留沒有顯著的影響，但在蛋白質(zhì)的活性回收上短鏈烴基（如C4，C8，苯基）和長鏈烷基（如C18，C22）反相填料是有區(qū)別的。表現(xiàn)在烷基鏈越長，固定相的疏水性越強(qiáng)，因而為使蛋白質(zhì)較快洗脫下來，需要增加流動相的有機(jī)成分。過強(qiáng)的疏水性和過多的有機(jī)溶劑會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的不可逆吸附和生物活性的損失。總起來說，在烷基鍵合硅膠上的反相色譜，由于其柱效高、分離度好、保留機(jī)制清楚，是蛋白質(zhì)的分離、分析、純化和結(jié)構(gòu)闡明廣泛使用的一種方法。
由于在反相色譜中，使用了乙腈、甲醇等價格高且有一定毒性的試劑，在一定程度上使該方法的使用受到限制。例如可使部分蛋白失活。因此，該方法用在分析鑒定方面更多一些，特別是對有機(jī)溶劑具有耐受性的樣品。例如多肽樣品，可用HPRPC對合成的肽huBPP進(jìn)行分析。
（一）實驗?zāi)康?/STRONG>
用HPRPC對huBPP進(jìn)行純度鑒定。
用HPRPC對huBPP進(jìn)行純度鑒定。
（二）材料和試劑
1，儀器：高效液相色譜儀，Beckman公司gold system.
2，色譜柱：⑴ 名稱：Diamonsil TM（鉆石） C18柱，5цm
⑵ 規(guī)格：250×4.6mm
3，試劑：甲醇（HPLC級）、三氟己酸（TFA）、乙腈 （HPLC級）、雙蒸水
（三）樣品準(zhǔn)備
取待分析的huBPP，稱量，用0.1%的TFA液溶解，配制成濃度大于1mg/ml的液體。必要時過濾或離心。
取待分析的huBPP，稱量，用0.1%的TFA液溶解，配制成濃度大于1mg/ml的液體。必要時過濾或離心。
（四）操作
1、液體準(zhǔn)備：A液0.1%TFA，B液液，99.9%乙腈，0.1%TFA，脫氣。
2、開機(jī)
3、上柱
4、輸入?yún)?shù)
檢測波長 245nm
流速 1ml/min
流動相： A液：0.1%TFA
B液：99.9%乙腈-0.1%TFA
洗脫條件：0-100% B 20min
5、平衡色譜柱 一般反相柱都保存在甲醇中，應(yīng)置換出甲醇，用A液平衡色譜柱，待基線平穩(wěn)后準(zhǔn)備上樣。必要時，可按洗脫條件不上樣運行一遍程序，以洗出色譜柱可能存在的雜質(zhì)。
6、上樣，取20цl樣，注入上樣閥，將閥門扳下，即上樣。
7、進(jìn)行分離，鑒定。
8、打印結(jié)果，并分析，可得到峰數(shù)，峰高，面積百分比，保留時間等參數(shù)。
9、用B液洗柱5min，若不再使用時，換成甲醇，洗滌后保存。
附：色譜柱操作說明，（以迪馬公司Diamonsil(TM)柱為例）
1. 色譜柱常規(guī)參數(shù)
訂貨號：Catalog.No. 產(chǎn)品專利號 Serial No.
出廠日期 Date
填料 Column Paking 如，Diamonsil(TM)鉆石C18 5цm
柱規(guī)格 Column Dimension 250×4.6mm
填料批號 Material Lot No. 0206
保證柱效 Guarantee Plate Number N>70,000/m(usp 1/2 Peak height)
不對稱因子 Asmmetry Factor As=0.8-1.4(5% Peak height)
測試報告 （附色譜圖） 略
2. 驗收色譜柱
⑴ 檢查色譜柱外觀是否完好。
⑵按柱參數(shù)逐項檢查是否與您的需求相符，如規(guī)格等。
3. 流動相使用
⑴檢查色譜柱允許使用流動相及pH，如，凝膠柱常規(guī)用緩沖液，反相柱用有機(jī)溶劑，鉆石C18柱允許pH為2-7.5。
⑵ 注意流動相的粘度對柱后的影響，如甲醇/水系統(tǒng)高于乙腈/水系統(tǒng)。
⑶ 流動相、樣品使用時過濾，常用0.45μm膜，分清水溶性和脂溶性膜。一般在色譜柱口有0.2μm的膜保護(hù)，以免堵塞色譜柱。
⑷ 流動相應(yīng)脫氣。
4. 色譜柱安裝
⑴ 確證柱與儀器的接頭，管路匹配。
⑵ 安裝柱之前，檢查流路系統(tǒng)中的溶劑是否正常。
⑶ 為減少死體積使進(jìn)樣閥與色譜柱和檢測器之間的連接管路內(nèi)徑盡量細(xì)，如0.01英寸。
5. 對樣品要求
⑴ 樣品應(yīng)與流動相互溶。
⑵ 樣品濃度要在一定范圍內(nèi)，不同色譜柱要求不同。
⑶ 樣品中不能有不溶物，用前應(yīng)用針頭或過濾器過濾。
⑷ 樣品不應(yīng)與流動相發(fā)生反應(yīng)。
6. 色譜柱的使用
⑴ 色譜柱最后封裝的溶劑一般與檢測報告相同或特別注明，若更換流動相時，流速要慢，一般不超過0.5ml/mim。
⑵ 請勿頻繁改變流動相，否則，會加速降低柱效。
⑶ 注意不同色譜柱耐壓程度不同，壓力要在柱耐壓范圍內(nèi)，為獲得最佳分離效果，鉆石C18柱使用勿超過200bar(300psi)。
⑷ 若使用保溫柱時，注意溫度影響。
7. 色譜柱的保存
⑴ 若流動相中使用鹽或酸試劑，保存前應(yīng)先用水沖洗干凈（約20倍柱體積）。
⑵ 泵入保存液，不同色譜柱用不同保存液，鉆石C18柱應(yīng)盡可能用100%乙腈或甲醇保存。
⑶ 卸下色譜柱后，立即用接頭密封，放在穩(wěn)定環(huán)境中保存。
8. 柱的再生
不同柱用不同方法再生，請參看各種色譜柱說明。
鉆石反相鍵合相C18、C8、pH、CN柱用以下程序：
用20倍柱體積的溶劑按下列程序沖洗色譜柱。（按箭頭方向沖）
水→甲醇→氯仿→甲醇
水沖洗時可用熱蒸溜水（55℃）或加入少量（0.8%）DMSO沖洗。
一般情況下不提倡反向沖洗色譜柱，必要時可反向沖。
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