學(xué)習(xí)和掌握外源基因?qū)�入真核�?xì)胞的主要方法——脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。了解外源基因進(jìn)入的一般性方法，觀測(cè)外源蛋白的表達(dá)（綠色熒光蛋白），為染色準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料。

二、實(shí)驗(yàn)原理

上圖所示是脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的示意圖，它顯示了外源質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞的一般過程。

外源基因進(jìn)入細(xì)胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法。電擊法是在細(xì)胞上短時(shí)間暫時(shí)性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入；磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細(xì)胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入細(xì)胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實(shí)驗(yàn)條件控制較嚴(yán)、難度較大；病毒法的前期準(zhǔn)備較復(fù)雜、而且可能對(duì)于細(xì)胞有較大影響；所以現(xiàn)在對(duì)于很多普通細(xì)胞系，一般的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法。

利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法最重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問題，通過實(shí)驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對(duì)于效率的提高有巨大的作用。

上圖是本次實(shí)驗(yàn)采用的脂質(zhì)體中陽離子組分的結(jié)構(gòu)的示意圖。

本次實(shí)驗(yàn)采用的脂質(zhì)體是promega公司的TransFast脂質(zhì)體試劑，它是一種陽離子脂質(zhì)體和中性脂質(zhì)體的混合物，是對(duì)于本次實(shí)驗(yàn)中采用的293T細(xì)胞優(yōu)化的轉(zhuǎn)染試劑。

三、實(shí)驗(yàn)材料與器材

1、材料

293T細(xì)胞
MyoD表達(dá)質(zhì)粒和EGFP表達(dá)質(zhì)粒
DMEM培養(yǎng)基
鏈霉素/青霉素（雙抗）
FCS（小牛血清）
PBS（磷酸鹽緩沖溶液）
胰酶/EDTA消化液
轉(zhuǎn)染試劑（TransFast）

2、器材

20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip頭
酒精燈
廢液缸
血球計(jì)數(shù)板
渦旋振蕩器
恒溫水浴箱
臺(tái)式離心機(jī)
35mm培養(yǎng)皿
轉(zhuǎn)染管
15ml離心管
觀察用倒置顯微鏡
熒光顯微鏡和CCD

四、 實(shí)驗(yàn)步驟

1、細(xì)胞傳代

（1） 試驗(yàn)準(zhǔn)備：200ul/1mlTip頭各一盒（以上物品均需高壓滅菌），酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號(hào)筆，培養(yǎng)皿，離心管。

（2） 棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。

（3） 用Tip頭加入1ml Trypsin液，消化1分鐘（37℃，5%CO₂ ）。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細(xì)胞完全從壁上脫落下來為止。

（4） 加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。

（5） 用Tip頭多次吹吸，使細(xì)胞完全分散開。

（6） 將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。

（7） 用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后選擇0.8X10⁶個(gè)細(xì)胞加入一個(gè)35mm培養(yǎng)皿。

（8） 將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細(xì)胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。

（9） 將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)染。

2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

（1）轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備

A. 將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。

B.震蕩后將試劑放在-20℃保存，使用前還需震蕩，。

（2） 選擇合適的混合比例（1：1-1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量）來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。

（3） 將混合液在室溫放置10-15分鐘。

（4）  吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。

（5） 加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。

（6） 到時(shí)后，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。

3、第二次細(xì)胞傳代

（1） 在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達(dá)情況。

（2） 再次進(jìn)行細(xì)胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X10⁵個(gè)細(xì)胞/35mm培養(yǎng)皿將細(xì)胞重新粉入培養(yǎng)皿中。

（3） 在正常條件下培養(yǎng)24小時(shí)后按照染色要求條件固定。

轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化可以參考TransFast的使用說明書。