Jonathan P. Danaceau, Kenneth J. Fountain, 和 Erin E. Chambers
沃特世公司(美國馬薩諸塞州米爾福德市)

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APPLICATION BENEFITS
■ 系統(tǒng)UPC²
■方法開發(fā)策略
■反相色譜的備用選擇
■分析速度快
■出色的極性分析物保留性能
■“綠色”流動相

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沃特世解決方案
ACQUITY UPC²™ 系統(tǒng)
ACQUITY UPC²色譜柱
ACQUITY® TQD 質(zhì)譜儀
MassLynx® 軟件

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關(guān)鍵詞
阿片類藥物，疼痛管理，UPC²/MS，方法開發(fā)，UPC²，合相色譜

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簡介
超高效合相色譜(UltraPerformance Convergence Chromatography™, UPC²™)是一種創(chuàng)新型技術(shù)，它將UPLC®的優(yōu)勢充分應(yīng)用至超臨界流體色譜(SFC)。UPC²是一種與UPLC正交的分析技術(shù)，可將具有高擴散系數(shù)的可再生“綠色”溶劑CO₂與多種互補型固定相結(jié)合使用，用于解決常規(guī)LC或GC分析遇到的眾多分離難題。由于多數(shù)分析化學(xué)家們對UPC²缺乏足夠的認(rèn)識，因此有必要為UPC²方法的開發(fā)和優(yōu)化提供直接的開發(fā)策略。

本文將UPC²應(yīng)用于一組天然和合成阿片類藥物的分析，演示UPC²方法的開發(fā)過程。這些化合物代表一類重要的臨床藥物。其相關(guān)應(yīng)用包括實驗室藥品檢測、疼痛管理監(jiān)測和藥物治療方案的合規(guī)性。除大約25年前出版的一份報告外，¹ 我們未曾發(fā)現(xiàn)應(yīng)用SFC分析阿片類藥物的任何報道。因此，我們決定通過分析這類重要化合物來評估UPC²
的實用性。

本應(yīng)用紀(jì)要重點突出了4種不同市售固定相結(jié)合4種不同有機輔助溶劑的系統(tǒng)性方法開發(fā)策略，該策略可快速確定方法開發(fā)的最優(yōu)初始條件。經(jīng)過初期篩選，最終通過直接快速的方法優(yōu)化建立了一種針對19種天然、半合成和合成阿片類藥物及其相關(guān)藥物的分析方法，該方法可用于疼痛管理、成癮治療和藥物濫用監(jiān)測。最終方法能夠在2 min內(nèi)完成所有化合物的分析，并獲得可接受的峰形，總循環(huán)時間為4 min。

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實驗
樣品描述
19種經(jīng)篩選過的化合物列于表1中，構(gòu)成一組綜合性實驗藥物組，包括用于疼痛管理的天然阿片類藥物、半合成阿片類及合成麻醉性鎮(zhèn)痛化合物。這些化合物多數(shù)為弱堿性，其pKa值大約為8-9。它們的極性范圍較廣，LogP值涵蓋羥嗎啡酮的0.78至美沙酮的5.0，如表1所示。MRM多反應(yīng)監(jiān)測轉(zhuǎn)換見表1。所有化合物的儲備溶液均用甲醇制備，工作溶液則以甲醇或異丙醇或乙腈/甲醇(60:40)為溶劑。工作溶液中所有化合物濃度均為500 ng/mL。

UPC²條件
系統(tǒng)：ACQUITY UPC²
色譜柱： ACQUITY UPC²BEH，2.1×50 mm，1.7µm (p/n 186006558)
柱溫： 55 ℃
進(jìn)樣體積： 2µL
流速： 1.5 mL/min
流動相A： CO₂
流動相B： 含0.4%甲酸和40 mM NH4COOH的甲醇
樣品瓶： LC/MS認(rèn)證的12×32 mm螺口最大回收(p/n 600000749CV)
梯度： 初始條件為2%的流動相B。流動相B在2 min內(nèi)增 加至50%，達(dá)到50%后保持0.5min。然后在0.1min內(nèi)流動相B返回到2%，重新平衡系統(tǒng)1.4 min。整個循環(huán)時間為4.0 min。

MS 條件
質(zhì)譜儀： ACQUITY TQD
補償泵流速： 含1%甲酸的甲醇(0.25 mL/min)
電離模式： ESI+
采集模式： MRM(請參閱表1了解離子躍遷)
毛細(xì)管電壓： 1 kV
碰撞能量： 針對各化合物優(yōu)化
錐孔電壓： 針對各化合物優(yōu)化
數(shù)據(jù)管理： MassLynx軟件

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結(jié)果與討論
初始條件篩選
本實驗利用色譜柱管理器考察4種不同化學(xué)性質(zhì)填料的色譜柱和4種不同的輔助溶劑，對一系列的運行條件進(jìn)行了篩選，確定出使用UPC²分析阿片類藥物的最佳起始條件。所用色譜柱分別為Waters® UPC²BEH、BEH 2-EP、CSH™氟-苯基和HSS C18 SB。流動相B為甲醇，加有以下添加劑：無(僅甲醇)、0.2%甲酸、0.2% NH4OH或0.2%甲酸+20 mM NH4COOH。初始篩選實驗的梯度由5%的流動相B開始，在4 min內(nèi)從5%增加至75%。然后在1 min內(nèi)返回到5%，并在初始條件下重新平衡色譜柱1.4 min。每根色譜柱的流速設(shè)置為確保系統(tǒng)反壓保持在6000 psi限值以下，BEH和2-EP色譜柱的流速為1.5 mL/min，HSS和PFP CSH氟-苯基色譜柱流速為1.0 mL/min。初始條件篩選實驗采用包括芬太尼、嗎啡、羥嗎啡酮、羥考酮和美沙酮在內(nèi)的幾個化合物進(jìn)行。這幾個化合物代表一系列的極性范圍，可簡化初始篩選過程。

在BEH色譜柱上對添加劑進(jìn)行的初步評價結(jié)果見圖1。所有化合物濃度均為500ng/mL。譜圖清楚的顯示：采用純甲醇和在甲醇中添加0.2%的甲酸時，羥考酮、羥嗎啡酮和嗎啡的MS峰形較寬，且峰強度偏低。相反，當(dāng)以0.2% NH4OH或0.2%甲酸+20mM NH4COOH為添加劑時，多數(shù)化合物(本次初始篩選所用化合物)的峰形均可接受。在堿性條件下，分析堿性化合物可獲得良好的色譜性能，這在SFC條件下分析阿片類藥物表現(xiàn)尤為明顯，上述結(jié)果與已有的報道相一致。1,2通過對下方的兩張色譜圖仔細(xì)分析可知，采用緩沖鹽添加劑相比僅以濃氨水為添加劑可獲得更好的保留性能和峰形。

采用圖1中所選流動相添加劑對不同色譜柱進(jìn)行篩選，相關(guān)結(jié)果見圖2。雖然譜圖中未顯示實驗數(shù)據(jù)(由BEH顆粒填充的色譜柱相關(guān)數(shù)據(jù))，但仍可發(fā)現(xiàn)以純甲醇或含甲酸的甲醇作為輔助溶劑時，所有色譜柱的性能表現(xiàn)均較差。另外，對于所有色譜柱，其分離性能與BEH色譜柱類型，使用0.2%氫氧化銨作為添加劑與僅使用甲醇或含0.2%甲酸的甲醇相比能更好地改善峰形，而在輔助溶劑中使用甲酸和甲酸銨的復(fù)合添加劑可獲得最佳的峰形、保留時間、分離度和靈敏度。圖2展示了在四種色譜柱中采用圖1D中所用緩沖流動相添加劑所得的色譜圖。使用由2-EP顆粒填充的色譜柱進(jìn)行分析時，除嗎啡外，其它化合物的峰形均不可接受。使用HSS C18 SB色譜柱時，所有被測化合物的峰形均較好，但與BEH或CSH氟-苯基色譜柱相比，峰分離度較差。采用CSH氟-苯基色譜柱時，所有峰均實現(xiàn)基線分離，但選擇性與BEH色譜柱略有不同。根據(jù)上述結(jié)果，我們決定采用BEH和CSH氟-苯基色譜柱進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件。

色譜條件優(yōu)化
采用已選定的緩沖添加劑(甲酸+NH4COOH)和BEH色譜柱(或CSH氟-苯基色譜柱)對剩余的化合物進(jìn)行測定分析。在這些條件下，除極少數(shù)化合物外，其它所有化合物均獲得的良好分離。正如所料，我們還需對混合物中的少數(shù)化合物進(jìn)行額外優(yōu)化。羥嗎啡酮和羥考酮為其中一組化合物。這兩種化合物較其它分析物具有嚴(yán)重的峰拖尾和峰變寬現(xiàn)象。兩峰的色譜圖見圖3A。羥考酮和羥嗎啡酮色譜峰在5%峰高處的峰寬分別為16.5s和22.5s，而嗎啡的峰寬為4s。溶質(zhì)與固定相之間的相互作用被認(rèn)為會顯著影響超臨界條件下的保留機制^2,4。據(jù)推測，化合物與固定相之間的次級相互作用可能會導(dǎo)致相關(guān)化合物的峰形變差。在嘗試最大程度降低任何可能的次級相互作用時，我們將輔助溶劑中添加劑的濃度增大了一倍，即0.4%甲酸和40 mM NH4COOH。上述條件的改變確實減小了這兩種化合物的峰寬，結(jié)果見圖3B。羥考酮和羥嗎啡酮的峰寬分別減小至7.2s和9.9s，與初始條件下的峰寬相比降低了50%以上。同樣重要的是，其它化合物的色譜性能未受到不利影響。

另一組測試化合物展示了許多弱極性化合物洗脫過早的色譜挑戰(zhàn)，這些化合物示例包括哌替啶、芬太尼、美沙酮、丙氧芬和丁丙諾啡。根據(jù)上述初步篩選的相關(guān)數(shù)據(jù)，采用CSH氟-苯基和BEH色譜柱分析這些化合物非常有希望獲得理想的結(jié)果；但是，在CSH氟-苯基色譜柱上使用“實驗”部分中所述的最終梯度條件進(jìn)行分析時，出現(xiàn)了分叉峰和較差的色譜結(jié)果，如圖4A和4B所示。對比之下，采用BEH色譜柱所得所有化合物的峰形均較好，這可能是由于使用此色譜柱可增強分析物的保留性能或減少溶劑的影響。圖4顯示了在以2% 輔助溶劑為起始梯度比率的最終條件下，采用CSH氟-苯基和BEH色譜柱分析丙氧芬和丁丙諾啡的相關(guān)色譜性能。這些譜圖清楚地顯示采用BEH色譜柱可改善峰形，可能是由于此色譜柱能夠增加分析物的保留性能。

本實驗中最后一項評估的參數(shù)是樣品稀釋劑的選擇。采用UPC²進(jìn)行分析的一個優(yōu)勢是其與樣品制備所用的溶劑兼容。無論是選擇固相萃取、液-液萃取還是蛋白質(zhì)沉淀，最終提取物常常溶解于可能與反相色譜條件不兼容的有機溶劑中，需對其處理才能進(jìn)樣分析。但是，UPC²可與多種有機溶劑兼容，省略了采用反相色譜系統(tǒng)時通常所需的蒸發(fā)和復(fù)溶步驟。在這些實驗過程中，采用沃特世Oasis® ­Elution樣品板時，通常選擇甲醇、IPA和乙腈/甲醇(60:40)復(fù)合溶液稀釋樣品。因此，我們對這三種溶劑進(jìn)行了考察。對比IPA和ACN/MeOH(60:40)稀釋劑時，未觀察到溶劑影響示例。僅采用甲醇作為樣品稀釋劑時可產(chǎn)生一些負(fù)面的色譜影響，如早期洗脫化合物(如芬太尼)的譜峰變寬和出現(xiàn)分叉。圖5為采用最終方法條件所得組合色譜圖。化合物的鑒定和保留時間列于表1中。其中圖5A為采用BEH色譜柱所得結(jié)果，圖5B為采用CSH氟-苯基色譜柱所得結(jié)果。色譜圖清楚地顯示：采用BEH色譜柱時，所有化合物的保留時間更長，且丙氧芬和丁丙諾啡(化合物18和16)的峰形獲得改善。該方法仍可在2 min內(nèi)檢出所有化合物，可用于此類化合物的快速篩選。

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結(jié)論
本應(yīng)用資料使用一組天然和合成的阿片類藥物分析來演示適用于UPC²方法開發(fā)的系統(tǒng)篩選策略。同時考察多種
不同化學(xué)性質(zhì)的色譜柱和多種不同的輔助溶劑及添加劑可快速確定首選的初始條件，便于進(jìn)一步優(yōu)化。簡單快
速的條件優(yōu)化建立了一種可在2 min內(nèi)分析19種不同阿片類藥物的方法，其中所有化合物的保留時間和峰形結(jié)果均較好。另外，此方法進(jìn)一步突顯了UPC²用于分析種類繁多的化合物的潛在適用性。
參考文獻(xiàn)
1. Janicot J, Caude M, et al. Separation of opium alkaloids by carbon dioxide sub- and supercritical fluid chromatography with packed columns; Application to the quantitative analysis of poppy straw extracts. Journal of Chromatography. 1988; 437: 351-364.
2. Grand-Guillaume Perrenoud A, Boccard J, et al. Analysis of basic compounds by supercritical fluid chromatography: Attempts to improve peak shape and maintain mass spectrometry compatibility. Journal of Chromatography A. 2012;1262(0): 205-213.
3. ChemAxon. Chemicalize.org. Retrieved Dec 15, 2012, from http://www.chemicalize.org/.
4. Lesellier E. Retention mechanisms in super/subcritical fluid chromatography on packed columns. Journal of Chromatography A. 2009; 1216(10): 1881-1890.