Matthew A. Lauber, Stephan M. Koza, 和 Kenneth J. Fountain
沃特世公司(美國馬薩諸塞州米爾福德)

應用優(yōu)勢
反相肽分離的峰容量更高
與甲酸流動相兼容
有應用于UPLC®和HPLC的兩種顆粒
CSH130 C₁₈ 使用細胞色素c 的胰蛋白
酶消化液進行QC檢驗

沃特世解決方案
ACQUITY UPLC® H-Class Bio系統(tǒng)
Xevo® G2 QTof質(zhì)譜儀
ACQUITY UPLC CSH130 C₁₈，1.7 μm色譜柱
XSelect™ CSH130 C₁₈ XP，2.5 μm色譜柱
MassPREP™肽混合物
經(jīng)LCGC認證的內(nèi)插管透明玻璃樣品瓶

關鍵詞
反相、肽、三氟乙酸(TFA)、甲酸(FA)、離子對、表面帶電雜化(CSH)、峰容量

引言
無論是通過自上而下的蛋白質(zhì)組學對蛋白質(zhì)進行研究¹還是運用肽圖表征生物藥物²，肽分離技術(shù)都極其重要。這些分析中所遇到的混合物均具有內(nèi)在的復雜性。因反相(RP)色譜法具有較高的分辨率，并且能夠輕松地與質(zhì)譜法(MS)銜接，它已成為首選的分離方法。與梯度反相色譜關系最緊密的性能指標是峰容量，或在梯度時間內(nèi)的最大峰數(shù)量³。有趣的是，除使用較小的填料顆粒外，對固定相進行化學修飾也可以對峰容量產(chǎn)生顯著的影響。例如，表面帶電雜化(CSHTM)C₁₈色譜柱的化學特性是對亞乙基橋雜化(BEH)C₁₈固定相的改進⁴，因為除了C₁₈鍵合相外，其表面經(jīng)修飾后還帶有低水平的正電荷5。業(yè)已表明，這種修飾能夠改善離子化小分子的峰形、載量行為和峰容量^5-10。

在本研究中，我們評估了CSH130 C₁₈的肽分離特性，期望能夠在色譜性方面得到相似的改善，因為在常用的酸性條件下，大部分肽都帶有正電荷。針對肽所做的研究表明，與肽分析中先進的固定相相比，這種新型的固定相能夠具有更大的峰容量、獨一無二的選擇性，并且對MS信號的依賴性更低。

LC條件
實驗
系統(tǒng)：Waters® ACQUITY UPLC H-Class Bio系統(tǒng)，配有一個20 cm或30 cm的柱溫箱(150 mm色譜柱采用20 cm柱溫箱；250 mm色譜柱采用30 cm柱溫箱)
檢測：配備500 nL分析流通池的ACQUITY UPLC TUV檢測器；Xevo G2 QTof質(zhì)譜儀
波長： 214 nm
掃描速率 ： 10 Hz
色譜柱:
ACQUITY UPLC BEH130 C₁₈，2.1 x 150 mm，1.7μm，多孔型，130 Å(部件編號186003556）
ACQUITY UPLC BEH130 C₁₈2.1 x 150 mm，1.7 μm，多孔型，130 Å (部件編號186006938)
XSelect CSH130 C₁₈ XP，2.1 x 150 mm，2.5 μm，多孔型，130 Å (部件編號186006943)
C₁₈，2.1 x 250 mm，5μm，多孔型，300 Å(競爭廠家產(chǎn)品)
C₁₈，2.1 x 150 mm,1.7μm，表面多孔型(核心1.25μm，外殼0.22μm)100 Å(競爭廠家產(chǎn)品)
柱溫： 40 °C
樣品溫度： 10℃
進樣量： 10 μL
流速： 0.3 mL/min
流動相： A：0.1%FA(v/v)水溶液      B:0.1%FA(v/v)的乙腈(ACN)溶液 C：0.1%三氟乙酸(TFA)(v/v)水溶液    D：0.1%TFA(v/v)的乙腈溶液
樣品瓶： 經(jīng)LCGC認證的透明玻璃瓶12 x 32 mm螺紋口樣品瓶(部分編號186001126C)
梯度： 2% ACN維持1分鐘，然后增加至50% ACN，維持60 分鐘（酸組分由定量配比的流動相A/B和C/D控制)。

質(zhì)譜條件
質(zhì)譜儀： Xevo G2 Qtof
電離模式： ESI+
分析儀模式： 分離度
毛細管電壓： 3.00 Kv
錐孔電壓： 25 V
離子源溫度： 120 ℃
脫溶劑溫度： 350℃
錐孔氣體流速： 0.0 L/h
脫溶劑氣體流速：800 L/h
校正： NaI 2 μg/μL，50 ~ 2000 m/z
采集： 50 ~ 1990 m/z，10 Hz 掃描速率
數(shù)據(jù)管理： MassLynx®軟件
樣品描述
如表1所示，MassPREP肽混合物(部件編號186002337)使用0.1%FA水溶液重新溶解，使總肽濃度大約為0.6 mg/mL。

結(jié)果與討論
肽分離

MassPREP肽混合物含有9種不同的肽，氨基酸組成、質(zhì)量、長度和極性各有不同。肽序列如表1所示。由于該混合物由這樣一組多樣的肽組成，所以對于評價質(zhì)譜性能和色譜性能是很有用的。鑒于此，相對于其他常用于肽分析的固定相，肽混合物被用作檢測CSH130 C₁₈的分離性能。本研究還包括用于高效分離混合物中大孔徑肽(100 Å ~ 300 Å)的固定相，這些肽的分子量均低于 3kDa。另一個單獨的應用紀要對使用130 Å孔徑的CSH130 C₁₈分離更大的多肽進行了討論。¹¹為了研究相關性，使混合物中每種肽的上樣量與抗體肽圖所用的常用條件接近，其中20 ~ 50 μg的Lys-C消化液或胰蛋白酶消化液一般在內(nèi)徑為2.0 mm或2.1 mm的色譜柱上進行分析。^2,12-13同樣，分離使用含有強離子對試劑TFA、較弱的離子對試劑FA或兩者結(jié)合的流動相完成。肽反相分離通常與質(zhì)譜聯(lián)用，在各種條件下得到的性能頗引人注意。在這些應用中，因為甲酸能夠提供靈敏度更高的檢測，所以選用甲酸而非三氟乙酸作為流動相添加劑。^14-15

圖1是在不同的流動相條件下使用一根5 μm硅膠C₁₈色譜柱得到的三張MassPREP的色譜圖。使用TFA進行分離得到的色譜峰一般都是對稱的。大部分色譜峰并未出現(xiàn)過度的峰展寬或拖尾的現(xiàn)象。但是，使用含有甲酸的流動相得到的峰形極不理想。此外，混合物中最大的肽——蜂毒素并未被檢測出來，原因可能是峰過寬或根本沒洗脫出來。對于使用HPLC進行的肽分離，這樣的結(jié)果是很常見的。

使用亞2 μm顆�？勺岆姆蛛x的性能更加優(yōu)越。在兩種均以1.7 μm顆粒填充的色譜柱上得到的色譜圖見圖2和圖3。特別是圖2中的色譜圖，它們使用表面多孔型C₁₈色譜柱得到。在流動相中加入TFA時，得到的色譜峰是對稱的，并且一般比使用5 μm多孔型C₁₈色譜柱得到的色譜峰更窄，如圖1所示。在流動相中加入極少量TFA或者不加TFA時，色譜峰變寬并出現(xiàn)明顯拖尾。在所有測試條件下，全多孔BEH130 C₁₈色譜柱分離的效果與表面多孔型C₁₈色譜柱相當，如圖3所示。

圖1至圖3表示的分離用于檢測CSH130 C₁₈,1.7 μm色譜柱肽分析的性能。對應的色譜圖如圖4所示。圖1至圖4的對比清楚表明，無論是使用含有TFA還是FA的流動相，與其他色譜柱不同的是，CSH130 C₁₈都能夠提供最佳的峰形。此外，可以明顯看到，CSH130 C₁₈ 表現(xiàn)出獨一無二的選擇性——尤其使用不含TFA的流動相情況下。例如，在流動相中僅加入0.1%的甲酸，在本研究所用的其他任何色譜柱上(CSH130 C₁₈除外)，肽8和肽9均未得到很好的分離。而使用CSH130 C₁₈時，這兩種洗脫是峰形對稱并在3分鐘以上的時間內(nèi)分實現(xiàn)分離。另外，這些色譜柱之間也存在保留能力的差異。最值得注意的是，CSH130 C₁₈色譜柱的保留能力稍弱于本研究涵蓋的其他色譜柱。這正好印證了CSH130 C₁₈是唯一一種表面帶有少量正電荷吸附劑的事實。帶正電荷的肽與CSH130 C₁₈表面之間的庫侖斥力很可能是CSH130 C₁₈保留能力較低的原因。圖4的插圖顯示了在CSH130 C₁₈色譜柱上使用0.1%FA梯度時的最早洗脫部分。在這些條件下，親水性最強的肽RASG-1(肽1)在孔隙體積標記附近出峰。與BEH130 C₁₈色譜柱相比，一般使用CSH130 C₁₈洗脫肽時所使用的ACN的量要少2% ~ 4%。 使用0.1%TFA時，保留能力的差異最小，而使用0.1%FA時，保留能力差異最大。分析極性很大的肽時，CSH130 C₁₈的初始梯度條件可能需要作相應的調(diào)整。

峰容量和質(zhì)譜信號
對這些定性分離的比較表明CSH130 C₁₈比其他色譜柱具有性能上的優(yōu)勢。但是，定量更引人注目。在每個分離中觀察到的峰容量按照實驗部分的方法計算。圖5A顯示了在每種色譜柱上酸性改進劑組成與峰容量之間的關系。圖5A的左部分是僅使用FA而不使用TFA離子對試劑得到的峰容量值。沿X軸向右是與FA濃度降低、TFA濃度升高時對應的峰容量值。CSH130 C₁₈色譜柱的性能優(yōu)勢很容易顯現(xiàn)出來。使用0.1%TFA時，CSH130 C₁₈色譜柱的峰容量比其他1.7 μm C₁₈色譜柱大20%。但是，如果使用含有0.1%甲酸的流動相，CSH130 C₁₈色譜柱的峰容量比其他1.7 μm色譜柱大90%。因此，CSH130 C₁₈不僅比其他色譜柱具有更大的峰容量，而且其性能對三氟乙酸的依賴性很小。由此帶來的最明顯效果是CSH130 C₁₈色譜柱與質(zhì)譜具有很高的兼容性。在這些分析中，三氟乙酸對肽質(zhì)譜檢測的影響見圖5B。我們知道，在電噴霧離子化過程中，TFA會引起嚴重的離子抑制^16-17。因此，使用TFA而不使用FA時，質(zhì)譜信號降低12倍。CSH130 C₁₈色譜柱并不需要太多TFA(如果有)來獲得最佳峰容量，因此成為需要高靈敏度LC/MS應用的理想選擇。

粒徑和UPLC/HPLC的放大性

許多肽分離操作仍在傳統(tǒng)的HPLC儀器上進行。因其背壓過高，使用亞2 μm填充的色譜柱通常不適合與HPLC系統(tǒng)聯(lián)用。而2.5 μm色譜柱因其背壓較低可以在任何LC儀器上使用。為確定CSH130 C₁₈,1.7μm色譜柱得到的峰容量是否可以成功轉(zhuǎn)移到CSH130 C₁₈ XP,2.5 μm色譜柱上，針對2.5 μm XP色譜柱設置了一種從一根1.7μm色譜柱轉(zhuǎn)移出來的HPLC兼容的方法。這種轉(zhuǎn)移如下所述：按照ACQUITY UPLC色譜柱計算器的建議¹⁸，將流速降低，增加梯度時間，降低和增加的系數(shù)均為1.5。圖6顯示，使用1.7 μm色譜柱進行的分離成功地轉(zhuǎn)移到了2.5μm XP色譜柱上。選擇性系數(shù)的一致性強調(diào)了這一觀察結(jié)果，如表2所示。與1.7顆粒的色譜柱相比，使用2.5μm XP顆粒進行分離時背壓出現(xiàn)極大地降低(~3000psi比 ~8000 psi)，從而表明了CSH技術(shù)可以輕松應用于UPLC或HPLC進行的高峰容量肽分離中。

結(jié)論

由于創(chuàng)新性的施加了低水平的正電荷，CSH 130 C₁₈色譜柱已經(jīng)被證明是一種能夠?qū)崿F(xiàn)肽分離的技術(shù)。根據(jù)對9種肽混合物進行分析，我們發(fā)現(xiàn)，與非表面帶電的C₁₈色譜柱相比，CSH 130 C₁₈顯示出更高的峰容量和獨一無二的選擇性。經(jīng)過觀察，CSH 130 C₁₈色譜柱的性能對強離子對試劑(例如TFA，可以抑制電噴霧離子化)的依賴性顯著降低。此外，在背壓較小的HPLC條件下，使用CSH 130 C₁₈,1.7 μm色譜柱得到的分離結(jié)果可以轉(zhuǎn)移到CSH 130 C₁₈,2.5 μm XP色譜柱上——盡管以犧牲分析時間為代價。CSH 130 C₁₈可以使用不同的粒徑，便于采用UPLC作為常規(guī)使用(以往這些實驗室的日常使用被限制在HPLC儀器上)，也可以拓展到壓力上限為9000~12000psi的UHPLC上。

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