使用超高效合相色譜(UPC2)分析人體尿液中的三環(huán)類抗抑郁藥
Erin Chambers和Kenneth J. Fountain
沃特世公司（美國馬薩諸塞州米爾福德市）
應用優(yōu)勢
沃特世解決方案
關鍵詞
合相色譜，Oasis，樣品制備，生物分析，三環(huán)類抗抑郁藥，定量，UPC2
簡介
三環(huán)類抗抑郁藥(TCA)是較老的一類藥物，但仍具有藥理學作用。例如，對其它類抗抑郁藥反應較差的藥物受試者仍較常見，由此決定了TCA仍具有持續(xù)的生存空間。此外，這類藥物比其它新型的抗抑郁藥要便宜得多，因此在門診中也有使用。過去，人們使用GC、 UV、 或LC/MS對TCA進行分析。UPC2™技術可對有機提取物進行分析，因此在生物分析測定領域備受青睞。有機提取物可通過此領域中最常見的樣品制備方法，例如蛋白質沉淀(PPT)、液-液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)法獲得。反相色譜系統(tǒng)在進樣前需對有機提取物進行蒸發(fā)和復溶，而非水溶劑系統(tǒng)則不需要此環(huán)節(jié)。UPC2技術具有主要溶劑(CO2)環(huán)保、可再生、可與反相色譜進行正交實驗、以及可利用多種固定相的特點，使其具備了低溶劑消耗和低成本的優(yōu)勢，從而增加了生物分析方法開發(fā)的選擇性和靈活性。因此，本實驗以人體尿液中TCA的分析為例，進行了一項確證UPC2分離適用性的論證性研究。研究中所用特定TCA的結構見圖1。雖然人們對GC和LC方法開發(fā)途徑有很好的定義并在常規(guī)應用中使用，但UPC2分離的方法開發(fā)仍是一塊較新的研究領域。本應用紀要中重點描述了某些關鍵的UPC2參數(shù)并提供了適用的篩選選項。例如，色譜柱化學性質、pH和進樣溶劑由色譜柱管理器和四元溶劑切換系統(tǒng)進行系統(tǒng)化的自動篩選。在選擇色譜柱、流動相和進樣溶劑后，系統(tǒng)將使用通過篩選試驗獲得的最佳條件對梯度進行優(yōu)化并分析尿樣提取物。在尿液檢測中，各抗抑郁藥的定量下限(LLOQ)0.1 ng/mL可輕松達到，符合FDA針對生物分析方法制定的LLOQ測定標準。另外，簡化的標準曲線（無內標物）在+/-1%至8%范圍內的線性和準確度良好。
實驗
UPC2條件
系統(tǒng)： ACQUITY UPC2
色譜柱： ACQUITY UPC2 BEH
2.1×50 mm，1.7 µm
流動相A： CO2
流動相B： 含0.2% NH4OH的甲醇
清洗溶劑： 60:40的乙腈/ 異丙醇+2%甲酸
分離模式： 流動相B在2 min內從2.0%增加至40%；達到30%時保持1 min。
流速： 1.4 mL/min
CCM反壓： 1750 psi
柱溫： 40 ℃
樣品溫度： 10 ℃
進樣體積： 2.0 µL
運行時間： 3.0 min
補液流速： 0.25 mL/min含0.2% NH4OH的異丙醇
收集板： 沃特世（Waters®） 1 mL ACQUITY®收集板
MS條件
質譜儀： Xevo TQ-S
電離模式： ESI+
毛細管電壓： 1.0 kV
碰撞能量： 按組分優(yōu)化（見表格1）
錐孔電壓： 按組分優(yōu)化 （見表格1）
數(shù)據管理
色譜軟件：MassLynx®
定量軟件：TargetLynx™
優(yōu)化軟件：IntelliStart™
圖1. 三環(huán)類抗抑郁藥分析物的結構式。
實驗
樣品描述
采用Oasis WCX 96孔 µElution板制備尿樣。首先，在200 µL樣品中加入200 µL的4% H3PO4溶液，混勻；先用200 µL甲醇平衡萃取板中的各孔，然后用200 µL水平衡；將樣品稀釋液(400 µL)加載到板上；依次用200 µL 10 mM醋酸銨溶液(pH 6)、200 µL甲醇淋洗；用含2%甲酸的ACN/MeOH(60:40)溶液洗脫TCA，每次25 µL，洗脫2次，合并洗脫液。取洗脫液2 µL直接注入ACQUITY UPC2系統(tǒng)。
儲備溶液和工作溶液均以甲醇為溶劑。向2 mL尿液中加入20 µL復合工作溶液（各化合物濃度為1 µg/mL）制成含5種抗抑郁藥的尿樣，此方法制成的尿樣濃度為10 ng/mL。其它濃度的樣品溶液通過使用對照人體尿液連續(xù)稀釋高濃度的標準溶液制備而得。在本論證性研究中，制備并用于萃取的尿樣最終濃度分別為：0.1、0.2、0.5、1.0、5.0和10.0 ng/mL。為確定定量下限(LLOQ)，實驗還對空白尿進行了萃取。
|
分析物 |
母離子m/z |
子離子m/z |
錐孔電壓(V) |
碰撞能量(eV) |
|
阿米替林 |
278.3 |
233.1 |
30 |
18 |
|
去甲替林 |
264.3 |
233.4 |
28 |
15 |
|
丙咪嗪 |
281.3 |
85.8 |
25 |
20 |
|
地昔帕明-D3 |
267.4 |
208.1 |
22 |
25 |
表1. 4種抗抑郁藥物組的MS條件。
結果與討論
之前已證明混合模式SPE是生物分析中最常選擇的一類樣品制備方法，這依賴于其分離分析物與內源性干擾物的雙正交保留機制。因此，混合模式SPE是本次實驗的首選。選用混合模式的弱陽離子交換劑基于以下兩個方面的原因：分析物呈堿性，需要通過離子交換保留；此特定吸附劑的最終洗脫液實際呈酸性。進樣溶劑的篩選結果表明，采用酸性進樣溶劑可獲得最佳的峰型和靈敏度（此處不作數(shù)據說明）。因此，Oasis WCX是不二之選。對通用的提取方法稍作修改，確保所有分析物通過離子交換可完全保留。人體尿液經SPE處理后，最終洗脫液中所有分析物的回收率為92%至104%，RSD為3%至6%。SPE洗脫液可直接進樣，不需做進一步的稀釋或蒸發(fā)，從而簡化了整個工作流程，提高了分析通量。
系統(tǒng)性色譜篩選
方法開發(fā)過程對色譜柱、改性劑和改性添加劑進行了系統(tǒng)篩選，以獲得最佳分離結果。經篩選的4種UPC2色譜柱如下：ACQUITY UPC2 BEH、BEH 2-EP、HSS C18 SB和 CSH™ Fluoro-Phenyl，所有色譜柱規(guī)格均為2.1×50 mm，填料粒徑為1.7 µm。3種流動相B溶劑分別為甲醇、含0.2%甲酸的甲醇和含0.2% NH4OH的甲醇。篩選過程采用流動相B在3 min內從2%增加至45%，達到45%時保持1.5 min的常用梯度。當以添加有氫氧化銨的甲醇作流動相時，各色譜柱分析所得的峰形、靈敏度和分離度均為最佳。四種固定相使用此高pH流動相所得分析結果的對比情況如圖2所示。除HSS SB色譜柱外，其它色譜柱的出峰順序相似。但是，由HSS SB色譜柱得出的譜峰明顯更寬，這將導致信噪比降低并影響低濃度樣品的檢測。峰變寬可能是由于分析物與固定相之間的次級相互作用所致。采用ACQUITY UPC2系統(tǒng)分析其它類化合物（本文未涉及此部分實驗內容）時發(fā)現(xiàn)：使用具有緩沖作用的流動相改性劑（如，20至40 mM的甲酸銨）可以改善峰形。在本文的研究中，色譜分析的主要目標不是使分析物達到絕對的基線分離，而是獲得最佳的峰形和最高靈敏度，因此我們對各色譜柱所得的峰面積進行了測定。在高pH改性劑條件下，使用各色譜柱得出的分析物峰面積如表2所示。
圖2：以含0.2% NH4OH的甲醇為流動相B時，不同固定相的分析結果。
|
BEH色譜柱 |
BEH 2-EP色譜柱 |
HSS C 18 SB色譜柱 |
CSH FP色譜柱 | |
|
阿米替林 |
1066581 |
940444 |
968946 |
940657 |
|
丙咪嗪 |
1291389 |
1180698 |
1690693 |
1145127 |
|
去甲替林 |
1586550 |
963422 |
1256074 |
1143857 |
|
地昔帕明 |
245922 |
149734 |
219268 |
208580 |
表2. 使用4種不同色譜柱所得的峰面積概覽表。
在不同色譜柱的篩選實驗中，阿米替林和丙咪嗪的峰面積無顯著變化，但地昔帕明和去甲替林受固定相化學性質的影響，峰面積發(fā)生了明顯改變。例如，地昔帕明在使用BEH色譜柱分析時所得峰面積較其它色譜柱增大了11%至40%。同樣，去甲替林的峰面積在BEH色譜柱分析條件下較其它色譜柱增大了21%至40%。雖然BEH 2-EP色譜柱的總體分離效果較其它色譜柱稍有改善，但采用BEH色譜柱時信號強度更高。因此BEH色譜柱是進行TCA低濃度水平定量分析的最佳選擇。此外，BEH色譜柱所得色譜峰的平均基線峰寬＜2 s，提高了低濃度樣品測定的信噪比。
運用各個色譜柱進行試驗時觀測到系統(tǒng)最大壓力低于4200 psi，系統(tǒng)在此低于壓力限值的條件下運行良好，可以靈活地根據需要提高流速，進一步縮短運行時間。
除對固定相進行了篩選外，本實驗還對不同的改性劑進行了評估。圖3所示為不同流動相B改性劑對ACQUITY UPC2 BEH色譜柱的影響，其它色譜柱受影響的趨勢與此相似。使用NH4OH作為改性劑時�？色@得最佳的分離度和峰形。單獨用甲醇作流動相時，所得譜峰最寬，洗脫時間最遲，分離度最差。選擇甲酸作為改性劑時，所得分析結果比使用NH4OH所得結果的保留時間增大，分離度降低且譜峰更寬。
為縮短運行時間并提高樣品分析通量，本實驗對篩選梯度進行了“壓縮”。結果表明，梯度壓縮后所得峰形、分離度和靈敏度均未受負面影響。最終的整個運行時間確定為3 min。
圖3：使用BEH色譜柱時，流動相B中加入不同改性劑后所得分析結果。
靈敏度、線性和定量準確度
本實驗還通過少量的研究對方法的準確度和線性進行了評估。使用濃度范圍為0.1-10.0 ng/mL的對照人體尿液制備簡化標準曲線（無內標物）。采用“實驗”部分最后確定的分析條件進行測定，按照1/x的加權系數(shù)計算所得的曲線呈線性，R2＞0.998，各標準曲線點理論濃度的平均偏差<8%。表3所示為阿米替林的典型標準曲線統(tǒng)計數(shù)據。對于所有分析物，0.1 ng/mL的LLOQ均可輕松實現(xiàn)。此濃度下，阿米替林、丙咪嗪、去甲替林和地昔帕明-D3的信噪比依次為334:1、292:1、590:1和66:1。各組分的信號強度是空白尿樣提取物信號的5倍，符合FDA的LLOQ測定標準。圖4所示為0.1 ng/mL地昔帕明-D3和空白尿液的典型提取離子色譜圖。
圖4. 空白尿液提取物(下方色譜圖)和含0.1 ng/mL地昔帕明-D3的尿液提取物(上方色譜圖)。
|
標準溶液濃度(ng/mL) |
保留時間 |
峰面積 |
與理論值之間的偏差% |
準確度% |
|
0.1 |
1.48 |
16161 |
-3.3 |
96.7 |
|
0.2 |
1.48 |
27061 |
2.7 |
102.7 |
|
0.5 |
1.48 |
60531 |
7.9 |
107.9 |
|
1.0 |
1.48 |
103149 |
-3.6 |
96.4 |
|
5.0 |
1.48 |
467997 |
-7.9 |
92.1 |
|
10.0 |
1.48 |
999886 |
-0.9 |
99.1 |
表3. 阿米替林(從人體尿液中提取)的典型標準曲線統(tǒng)計數(shù)據。
結論
UPC2技術成功應用于人體尿液中TCA的分析和定量。主要參數(shù)的自動篩選功能為本研究組中的4種TCA提供了極好的分離度和譜峰強度。對篩選出的梯度條件略作調整后，最終的總運行時間為3 min，尿液樣品由Oasis WCX 96孔µElution板進行提取處理。人體尿液中提取TCA的回收率范圍為92%至104%。簡化標準曲線溶液的濃度范圍為0.1-10.0 ng/mL，曲線上各點呈線性分布，平均準確度為99%。各分析物的LLOQ均可達到0.1ng/mL，足以滿足生物分析的要求。
總的來說，本應用紀要展現(xiàn)了UPC2這種新型分離技術在生物分析這一重要應用領域中的實用性和應用優(yōu)勢。UPC2技術使用綠色環(huán)保的CO2作為主要流動相、樣品無需稀釋或濃縮即可直接進樣，另具公認的正交性（對反相色譜而言），使其在生物基質中藥物的分析定量方面?zhèn)涫芮嗖A。
