賈偉

沃特世科技（上海）有限公司實(shí)驗(yàn)中心

 

液質(zhì)數(shù)據(jù)中，不但含有蛋白藥序列表達(dá)是否正確的肽圖信息，其它雜質(zhì)蛋白同樣可以被挖掘出來。然而，單純的雜質(zhì)蛋白鑒定卻又是不夠遠(yuǎn)遠(yuǎn)的，其確切的含量信息同樣至關(guān)重要。沃特世PLGS軟件可以在肽圖液質(zhì)數(shù)據(jù)中，進(jìn)一步鑒定其中的雜質(zhì)蛋白，并其相對含量信息進(jìn)行分析。

 

使用相應(yīng)的開放數(shù)據(jù)庫，PLGS軟件首先根據(jù)液質(zhì)數(shù)據(jù)中的離子碎片信息對多肽進(jìn)行鑒定，進(jìn)而組裝出樣品中的所有蛋白，完成蛋白鑒定步驟。在蛋白相對含量測定中，PLGS軟件充分利用了MS^E全信息串聯(lián)質(zhì)譜方法的數(shù)據(jù)優(yōu)點(diǎn)。較DDA方法，MS^E數(shù)據(jù)的離子色譜峰近乎“完美”，更加符合實(shí)際多肽色譜峰型。通過全面研究發(fā)現(xiàn)，MS^E數(shù)據(jù)中的多肽色譜峰強(qiáng)度信息，與蛋白濃度相關(guān)性非常好。使用每個(gè)蛋白鑒定多肽中，強(qiáng)度前三的多肽峰強(qiáng)度加和值，即表征其蛋白濃度。因此，使用PLGS分析同一個(gè)肽圖液質(zhì)數(shù)據(jù)，便可“順便”完成雜質(zhì)蛋白的鑒定與相對定量工作。

 

如果想得到樣品中準(zhǔn)確的蛋白絕對濃度信息，也非常簡單。只需在樣品中加入一個(gè)已知的蛋白內(nèi)標(biāo)便可。這時(shí)Hi3分析方法會(huì)根據(jù)內(nèi)標(biāo)蛋白的濃度，按照以下公式，對樣品中的絕對濃度進(jìn)行定量[1,2]。

 

 

融合抗體anti-phosphotyrosine IgG 1 (PTG1 mAb)使用中國倉鼠卵巢細(xì)胞系DG-44 CHO在兩種培養(yǎng)條件下表達(dá)，表達(dá)后的PTG1 mAb再分別使用A、B兩種方法純化。經(jīng)過2D-UPLC MSE方法采集液質(zhì)數(shù)據(jù)后，使用PLGS軟件分析[3]。在分析結(jié)果中，可以明確地給出鑒定到樣品中含有的雜質(zhì)蛋白，以及給出這些雜質(zhì)蛋白的相對含量結(jié)果（圖1）。為了驗(yàn)證Hi3定量方法的可靠性，使用MRM方法對以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果中Clusterin、Elongation factor 1-alpha、Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase三個(gè)蛋白進(jìn)行了定量驗(yàn)證。通過Hi3與MRM兩種定量方法結(jié)果對比，可以發(fā)現(xiàn)兩者定量濃度非常接近（圖2）。在使用PLGS進(jìn)行樣品中的雜質(zhì)蛋白鑒定與定量分析中，檢索方法設(shè)置與肽圖分析幾乎一致，只增加將參考蛋白的名稱與濃度列入分析參數(shù)一步。之后，所有的分析過程都將由PLGS自行完成，并直接給出蛋白鑒定身份與濃度的結(jié)果列表。實(shí)際上PLGS不僅使用在生物藥雜質(zhì)蛋白分析中，在樣品極為復(fù)雜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，Hi3

方法已經(jīng)被長期使用，并有眾多高水平論文發(fā)表[4,5,6]。

圖1. 雜質(zhì)蛋白鑒定結(jié)果及其含量。

 

參考文獻(xiàn)

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(4) Tenzer S, Wee E, Burgevin A, Stewart-Jones G, Friis L, Lamberth K, Chang CH, Harndahl M, Weimershaus M, Gerstoft J, Akkad N, Klenerman P, Fugger L, Jones EY, McMichael AJ, Buus S, Schild H, van Endert P, Iversen AK. Antigen processing influences HIV-specific cytotoxic T lymphocyte immunodominance. Nat Immunol. 2009, 10,

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