454高通量測序——研究土壤微生物的新手段
在陸地生態(tài)系統(tǒng)中，在土壤中生活有數(shù)量龐大的微生物種群，包括原核微生物如細菌、藍細菌、放線菌及超顯微結構微生物, 以及真核生物如真菌、藻類( 藍藻除外) 、地衣等。它們與植物和動物有著明確的分工，主要扮演“分解者”的角色，幾乎參與土壤中一切生物和生物化學反應，擔負著地球C、N、P、S 等物質循環(huán)的“調節(jié)器”[1]、土壤養(yǎng)分植物有效性的“轉化器”和污染環(huán)境的“凈化器”等多方面生態(tài)功能[2]。土壤微生物是氣候和土壤環(huán)境條件變化的敏感指標，土壤微生物群落結構和多樣性及其變化在一定程度上反映了土壤的質量。土壤微生物多樣性一般包括微生物分類群的多樣性、遺傳(基因) 多樣性、生態(tài)特征多樣性和功能多樣性[3]。由于土壤微生物的復雜性、土壤本身的多變性和研究方法不完善等原因的限制, 以往人們對土壤微生物多樣性的研究與動、植物相比遠遠落后。隨著多聚酶鏈反應(PCR)、核酸測序等現(xiàn)代生物學分子生物學技術的迅速發(fā)展, 人們對土壤微生物多樣性有了更多的了解；高通量測序技術的發(fā)展則為研究土壤宏基因組提供了大量數(shù)據(jù)，為直接探究土壤中的微生物群落結構提供了客觀而全面的信息。
一、對土壤微生物進行研究的方法
1、微生物平板培養(yǎng)法
傳統(tǒng)的土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落多樣性及結構分析大多是將微生物進行分離培養(yǎng)，然后通過一般的生物化學性狀，或者特定的表現(xiàn)型來分析，局限于從固體培養(yǎng)基上分離微生物。
這種方法只限于極少量（0.1%-1%）可以培養(yǎng)的微生物類群，無法對絕大多數(shù)微生物的分類地位和系統(tǒng)發(fā)育關系的深入研究。
2、分子生物學技術結合測序的方法
在過去的20多年里，分子生物學技術，尤其16SrDNA技術已經(jīng)廣泛應用于鑒定未知菌的研究中。20世紀80年代以來, 逐步建立起了以分子系統(tǒng)發(fā)育分析為基礎的現(xiàn)代微生物分子生態(tài)學的研究方法, 如PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-SSCP、熒光原位雜交技術(FISH)、基因芯片(Microarry) 、磷脂脂肪酸圖譜分析( Phospholipid fatty acid, PLFA) 、穩(wěn)定同位素探針( Stable Isotope Probing, SIP) 、PCR-DGGE/TGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE/Temperature gradient gel electrophoresis, TGGE) 等, 使得研究者能夠在分子水平上對土壤微生物多樣性進行研究。
其中運用比較廣泛并被普遍認可的是PCR-DGGE/TGGE法。DGGE/TGGE 的局限性在于，檢測的DNA片段長度范圍以200bp ～900bp為佳，超出此范圍的片段難以檢測[4]，PCR 擴增所需G/C 堿基對含量至少達40 % ，通常只能檢測到環(huán)境中優(yōu)勢菌群的存在，只有占整個群落細菌數(shù)量約1％或以上的類群能夠通過DGGE檢測到[5]。TGGE 儀器所允許的溫度范圍為15 ℃～80 ℃，較大片段DNA 的Tm 值因為接近80 ℃而使檢測難度提高；若電泳條件不適宜，不能完全保證將有序列差異的DNA片段分開，從而出現(xiàn)序列不同的DNA 遷移在同一位置的現(xiàn)象。
3、高通量測序方法
近年來，16S rRNA/DNA為基礎的分子生物學技術已成為普遍接受的方法[6,7 ]。研究表明，400～600堿基的序列，足以對環(huán)境中微生物的多樣性和種群分類進行初步的估計[8]，因此454高通量測序的方法因其讀長（400~500bp）長和準確性高的特點大量用于微生物多樣性的研究。
有了微生物16S rDNA序列，不論是全長還是部分，都可以提交到GenBank采用BLAST程序與已知序列進行相似性分析。Gen Bank將按照與測得序列的相似性高低列出已知序列名單、相似性程度以及這些序列相對應的微生物種類，但更為精確的微生物分類還取決于系統(tǒng)發(fā)育分析(phylogenetic analysis)。
高通量測序的優(yōu)越性體現(xiàn)在：測序序列長，可以覆蓋16S /18S rDNA、ITS等高變區(qū)域； 測序通量高，可以檢測到環(huán)境樣品中的痕量微生物；實驗操作簡單、結果穩(wěn)定，可重復性強；無需進行復雜的文庫構建，微生物DNA擴增產(chǎn)物可以直接進行測序，實驗周期短；測序數(shù)據(jù)便于進行生物信息分析。
該方法得到頂級期刊的認可（Nature等），已成為土壤微生物多樣性檢測的重要手段。上海美吉生物公司已有若干成功案例，為客戶提供的土壤樣本進行高通量測序并進行生物信息學分析。高通量測序因其數(shù)據(jù)量大，操作過程簡單，盡可能避免了繁瑣的實驗操作過程所造成的樣本損失，能夠相對客觀的反應出土壤樣本的真實情況。
二、高通量測序在土壤微生物研究中的應用
1.1 研究土壤微生物的物種多樣性
微生物物種多樣性主要從對微生物類群即細菌、真菌和放線菌這三大類群的數(shù)量及其比例組成來描述微生物多樣性，或者按照微生物在生態(tài)系統(tǒng)中的作用將其劃分成不同的功能群(function group)，通過某一功能群中物種的分類及其數(shù)量來研究土壤微生物多樣性，如對土壤中的產(chǎn)甲烷細菌、固氮菌、根瘤菌等的多樣性進行研究。以下是幾篇具有代表性的文章。
Roesch等[9]采用454測序法對西半球的一個大的橫斷面的4類土壤進行檢測和統(tǒng)計學評價。結果表明，這4種土壤中，最豐富的微生物類群擬桿菌綱、β-變形菌綱和α-變形菌綱。與農(nóng)業(yè)土壤相比，森林土壤的微生物多樣性更為豐富，然而檢測結果表明森林土壤中的古生菌多樣性較少，僅為該位點所有序列的0.009%，而農(nóng)業(yè)土壤的比例則為4% -12%。
土壤中細菌的多樣性差距非常大，因土壤結構的不同土壤中的細菌群體也呈現(xiàn)出多樣化。Triplett等[10]基于焦磷酸測序法來對16S rRNA的V2-V3區(qū)域進行測序，估測9個草地土壤中的菌群的整體和垂直特性。對所有752,838條數(shù)據(jù)序列進行聚類分析，探索菌群在豐度、多樣性和組成成分等方面的特異性。作者發(fā)現(xiàn)在不同的土壤層中，細菌系統(tǒng)發(fā)生的種群或者亞群的不同分配是與土壤的性質有關的，包括有機碳含量、總含氮水平或者微生物生物量。
1.2 研究土壤微生物功能多樣性
土壤微生物功能多樣性指包括微生物活性、底物代謝能力及與N、P、S 等營養(yǎng)元素在土壤中轉化相關的功能等，通過分析測定土壤中的一些轉化過程, 如有機碳、硝化作用以及土壤中酶的活性等來了解土壤微生物功能。
氨氧化反應是硝化作用的第一步，也是全球氮循環(huán)中由微生物活動形成硝化鹽的重要進程。Leininger[11]檢測了3個氣候區(qū)域12塊原始和農(nóng)業(yè)用地的土壤里編碼氨單加氧酶(amoA)的一個亞基的基因豐度。采用反向轉錄定量PCR研究及無需克隆的焦磷酸測序技術對互補DNA測序，證實古細菌的氨氧化活性要遠高于細菌，證實Crenarchaeota可能是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最富有氨氧化活性的微生物。
Urich等[12]采用基于RNA的環(huán)境轉錄組學方法同時獲得土壤微生物種群結構和功能信息。結果認為，通過該方法可以同時研究微生物生種群結構與功能從而避免其他方法所造成的偏差。群落基因組學分析可以通過研究微生物基因組序列與某些表達特征之間的關系，獲得一些微生物功能方面的信息。但同時也需要運用其他方法將特定功能與具有這種特定功能的微生物群落結構對應起來。對rRNA表達基因和與環(huán)境因素相關的主要酶類的基因進行定量化和比較分析，將能了解微生物結構與特定功能之間的關系，如硝化、反硝化和污染物降解。
反硝化作用是參與到氮流失和溫室氣體排放等氮循環(huán)過程的重要流程之一。通過宏基因組測序的方法，結合分子檢測和焦磷酸測序，Ryan等分離鑒定了操縱編碼反硝化過程的酶類。通過篩選77,000個土壤宏基因組文庫中得到的克隆，最終分離并鑒定了9個參與反硝化作用的酶簇[13]。
1.3 研究環(huán)境的突然變化對土壤微生物菌群的影響
環(huán)境的突然改變會導致微生物群落的結構和功能發(fā)生變化。Zachary等[14]以重水穩(wěn)定同位素探測技術（H218O-SIP）鑒定與土壤增濕相關的細菌。通過液相色譜/質譜（LC-MS），作者確定H218O中的氧原子結合到了所有的DNA結構成分中。盡管這種結合不是均勻的，還是可以明顯的將標記了18O和未標記的DNA區(qū)分開來。作者發(fā)現(xiàn)DNA和細胞外的H2O中的氧原子在體外沒有發(fā)生交換，表明摻入DNA的18O是相對穩(wěn)定的，并且摻入到細菌DNA中的18O的比例較高（48-72h）。土壤增濕后，對土壤中16S rRNA進行高通量測序，發(fā)現(xiàn)Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria的相對比例升高，而Chloroflexi和Deltaproteobacteria的比例則降低。作者通過控制土壤濕度的動態(tài)變化，對微生物菌群的結構發(fā)生變化進行研究和生態(tài)類群的劃分。
注：已用454焦磷酸測序法發(fā)表的文章總結
1、Archaea predominate among ammonia-oxidizing prokaryotes in soils
—— (2006) Nature 442: 806-809——if 36.101
2、454 Pyrosequencing analyses of forest soils reveal an unexpectedly high fungal diversity.
——(2009) New Phytologist 184(2): 449-56.——if 6.516
3、Vertical distribution of fungal communities in tallgrass prairie soil.
——(2010) Mycologia 102(5): 1027-41.——if 6.2
4、A comprehensive survey of soil acidobacterial diversity using pyrosequencing and clone library analyses.
——(2009) ISME Journal 3(4): 442-53——if 6.153
5、Pyrosequencing enumerates and contrasts soil microbial diversity
——(2008) The ISME Journal 1: 283–290——if 6.153
6、Bacterial diversity in rhizosphere soil from Antarctic vascular plants of Admiralty Bay, maritime Antarctica.
——(2010) ISME Journal 4(8): 989-1001.——if 6.152
7、Effect of storage conditions on the assessment of bacterial community structure in soil and human-associated samples.
7、Effect of storage conditions on the assessment of bacterial community structure in soil and human-associated samples.
——(2010) FEMS Microbiology Letters 307(1): 80-6.——if 6.152
8、Soil bacterial and fungal communities across a pH gradient in an arable soil.
——(2010) ISME Journal ePub:——if 4.42
9、Examining the global distribution of dominant archaeal populations in soil.
—— (2010) ISME Journal ePub: ——if 4.42
10、Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome .
—— (2008) PloS One 3:——if 4.411
11、Characterization of trapped lignin-degrading microbes in tropical forest soil.
——(2011) PLoS One 6(4): e19306.——if 4.411
12、Impact of biochar application to soil on the root-associated bacterial community structure of fully developed greenhouse pepper plants.
——(2011) Appl Environ Microbiol ePub:——if 3.8
13、Validation of heavy-water stable isotope probing for the characterization of rapidly responding soil bacteria.
13、Validation of heavy-water stable isotope probing for the characterization of rapidly responding soil bacteria.
——(2011) Appl Eviron Microbiol ePub:——if 3.8
14、Identification of Nitrogen-Incorporating Bacteria in Petroleum-Contaminated Arctic Soils Using 15N DNA-SIP and Pyrosequencing.
14、Identification of Nitrogen-Incorporating Bacteria in Petroleum-Contaminated Arctic Soils Using 15N DNA-SIP and Pyrosequencing.
——(2011) Appl Environ Microbiol ePub: ——if 3.8
15、Pyrosequencing-based assessment of bacterial community structure along different management types in german forest and grassland soils.
——(2011) PLoS One 6(2): e17000.——if 3.8
16、Assessment of soil fungal communities using pyrosequencing.
——(2010) Journal of Microbiology 48(3): 284-9.——if 3.8
17、Disclosing arbuscular mycorrhizal fungal biodiversity in soil through a land-use gradient using a pyrosequencing approach.
17、Disclosing arbuscular mycorrhizal fungal biodiversity in soil through a land-use gradient using a pyrosequencing approach.
——(2009) Environmental Microbiology ePub:——if 3.778
18、Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil.
Feinstein LM, Sul WJ, Blackwood CB. (2009) Appl Environ Microbiol 75(16): 5428-33.——if 3.778
19、Characterization of denitrification gene clusters of soil bacteria via a metagenomic approach.
——(2009) Applied Environmental Microbiology 75(2): 534-7——if 3.778
20、Tag-encoded pyrosequencing analysis of bacterial diversity in a single soil type as affected by management and land use.
20、Tag-encoded pyrosequencing analysis of bacterial diversity in a single soil type as affected by management and land use.
——(2008) Soil Biology and Biochemistry 40: 2762-2770——if 3.242
21、Shifts in microbial community structure along an ecological gradient of hypersaline soils and sediments.
——(2010) ISME Journal 4(6): 829-38.——if 2.039
22、Metagenomic comparison of direct and indirect soil DNA extraction approaches.
——(2011)Microbiol Methods ePub: ——if 2.018
23、Horizon-specific bacterial community composition of German grassland soils as revealed by pyrosequencing-based analysis of 16S rRNA genes.
—— (2010) Appl Environ Microbiol 76(20): 6751-9.
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