四、GC Clamp GC鉗

引物與目的位點(diǎn)的有效結(jié)合需要有穩(wěn)定的5 末端。這一段有較強(qiáng)穩(wěn)定性的5 末端稱為GC鉗。它保證引物與模板的穩(wěn)定結(jié)合。選擇有合適穩(wěn)定性的引物能在確保不產(chǎn)生非特異性條帶的前提下盡量降低退火溫度。

五、Secondary Structures二級(jí)結(jié)構(gòu)

二級(jí)結(jié)構(gòu)是引物設(shè)計(jì)中必須考慮的一個(gè)重要因素。二級(jí)結(jié)構(gòu)能顯著影響反應(yīng)中能與模板正確結(jié)合的引物數(shù)量，發(fā)卡結(jié)構(gòu)的存在能限制引物與目的位點(diǎn)的結(jié)合能力，從而降低擴(kuò)增效率，形成發(fā)卡環(huán)的引物則不能在PCR擴(kuò)增中發(fā)揮作用。

六、Hairpin發(fā)卡結(jié)構(gòu)

發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成是由于引物自身的互補(bǔ)堿基分子內(nèi)配對(duì)造成引物折疊形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并由于發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成是分子內(nèi)的反應(yīng),僅僅需要三個(gè)連續(xù)堿基配對(duì)就可以形成。發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性可以用自由能衡量。自由能大小取決于堿基配對(duì)釋放的能量以及折疊DNA形成發(fā)卡環(huán)所需要的能量，如果自由能值大于0 則該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定從而不會(huì)干擾反應(yīng)，如果自由能值小于0 則該結(jié)構(gòu)可以干擾反應(yīng)。

七、Dimer 二聚體

引物之間的配對(duì)區(qū)域能形成引物二聚體，它是相同或不同的兩條引物之間形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)。它造成引物二聚體擴(kuò)增并減少目的擴(kuò)增產(chǎn)物，二聚體可以在序列相同的兩條引物或正反向引物之間形成，如果配對(duì)區(qū)域在3 末端問(wèn)題會(huì)更為嚴(yán)重，3 末端配對(duì)很容易引起引物二聚體擴(kuò)增。

八、False Priming 錯(cuò)配

如果引物可以結(jié)合除目的位點(diǎn)外的其他區(qū)域，擴(kuò)增效率將明顯降低目的產(chǎn)物帶將減少或出現(xiàn)涂布（smear）。3 末端連續(xù)幾個(gè)堿基配對(duì)形成錯(cuò)配的傾向要高于引物上游區(qū)域同樣數(shù)量的堿基配對(duì)，在使用引物設(shè)計(jì)軟件時(shí)，您可以分別設(shè)定確認(rèn)為錯(cuò)配的3 末端或引物全長(zhǎng)形成連續(xù)堿基配對(duì)的數(shù)量。

九、自由能問(wèn)題（如何根據(jù)自由能判斷引物質(zhì)量）

1、ΔG值(自由能)反映了引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度。一般情況下，引物的ΔG值最好呈正弦曲線形狀，即5’端和中間ΔG值較高，而3’端ΔG值相對(duì)較低，且不要超過(guò)9（ΔG值為負(fù)值，這里取絕對(duì)值），如此則有利于正確引發(fā)反應(yīng)而可防止錯(cuò)誤引發(fā)。3′末端雙鏈的ΔG是0～－2 kcal/mol時(shí)，PCR產(chǎn)量幾乎達(dá)到百分之百，隨著其絕對(duì)值的增加產(chǎn)量逐漸下降，在－6時(shí)只有40%、到－8時(shí)少于20%、而－10時(shí)接近于0。

2、引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能量一般不要超過(guò)4.5，否則容易產(chǎn)生引物二聚體帶而且會(huì)降低引物濃度從而導(dǎo)致PCR 正常反應(yīng)不能進(jìn)行，與二聚體相關(guān)的一個(gè)參數(shù)是堿基的分布，3’端的連續(xù)GGG 或CCC 會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。二聚體形成的能值越高越穩(wěn)定，越不符合要求。與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。雖然有些帶有發(fā)夾環(huán)，其ΔG為－3 kcal/mol的自身互補(bǔ)引物也可以得到不錯(cuò)的結(jié)果，但是如果它的3′末端被發(fā)夾環(huán)占據(jù)時(shí)就很麻煩，即會(huì)引發(fā)引物內(nèi)部的延伸反應(yīng)，減少了參與正式反應(yīng)引物的數(shù)量。當(dāng)然，如果發(fā)夾環(huán)在5′末端對(duì)反應(yīng)就沒(méi)有多大的影響了。

十、產(chǎn)物需要測(cè)序的PCR引物的設(shè)計(jì)問(wèn)題

在DNA測(cè)序的PCR中最好用5′末端穩(wěn)定(如GC含量較多)，而3′末端不太穩(wěn)定(如AT含量較多)的引物，這種引物的結(jié)構(gòu)可以有效地消除假引發(fā)反應(yīng)。這就是基于引物內(nèi)部穩(wěn)定性的經(jīng)驗(yàn)之談。其3′末端穩(wěn)定性低的引物在這些反應(yīng)中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的堿基與非靶位點(diǎn)堿基所形成的配對(duì)的穩(wěn)定程度還不足以引發(fā)DNA合成，所以不會(huì)產(chǎn)生假產(chǎn)物。因此，為了有效地引發(fā)反應(yīng)，引物的5′末端和中央部分必須與靶DNA也形成雙鏈。與此相反，帶有穩(wěn)定的、GC豐富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都與靶序列配對(duì)，只憑借其3′末端與靶序列任何位點(diǎn)的牢固配合就可以引發(fā)反應(yīng)，產(chǎn)生非專一產(chǎn)物。無(wú)論如何，寡核苷酸3′末端最后5個(gè)核苷酸的穩(wěn)定性小于－9 kcal/mol的，通常就是專一性的探針或引物。寡核苷酸3′末端越不穩(wěn)定，假引發(fā)的可能性越低。

順便說(shuō)一下，如果新手剛開始接觸引物設(shè)計(jì)，推薦使用Primer Premier 5.0，因?yàn)樗�界面�?jiǎn)單，易學(xué)易用；如果你想把引物設(shè)計(jì)得盡善盡美，公認(rèn)的首選軟件是Oligo，其次我認(rèn)為是DNAstar。Oligo功能強(qiáng)大，所以使用起來(lái)就沒(méi)有Primer Premier 5.0那么簡(jiǎn)便。先用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)，然后把設(shè)計(jì)好的引物拿到Oligo里去檢測(cè)這對(duì)引物的優(yōu)劣，我想這對(duì)大多數(shù)引物設(shè)計(jì)者是一個(gè)不錯(cuò)的選擇!