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多巴胺ELISA試劑盒使用說明

瀏覽次數(shù)：2259　發(fā)布日期：2011-9-7　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責任自負

多巴胺ELISA試劑盒使用說明

（德國IBL：RE59161）

1、 應用范圍

此試劑盒可用于人血漿和尿液中多巴胺的體外定量檢測，可手動操作，也可自動操作。進一步的研究表明：此試劑盒還可用于組織勻漿和細胞培養(yǎng)上清液的研究。

2、前言說明

兒茶酚氨類激素腎上腺素、去甲腎上腺素和多巴胺主要由腎上腺髓質(zhì)、交感神經(jīng)系統(tǒng)和大腦產(chǎn)生。它們幾乎影響所有的組織，并與其它激素和神經(jīng)系統(tǒng)一起參與各種生理過程的調(diào)節(jié)。在許多疾病中，兒茶酚氨激素及其代謝產(chǎn)物間甲腎上腺素和去甲變腎上腺素的分泌量都會增加，因而這些激素可用于疾病的診斷。所以，這些激素的檢測對于疾病的診斷及神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤疾病的具有重要意義。它主要用于嗜鉻細胞瘤的診斷，當然也用于成神經(jīng)細胞瘤和神經(jīng)節(jié)細胞瘤的診斷。因為在實驗一開始時有提取步驟，所以用戶可使用各種各樣的動物材料進行實驗。如果用此試劑盒測大鼠、小鼠或其它動物，則兒茶酚氨的化學結構與動物的相同。

3、實驗原理

此固相酶聯(lián)免疫吸附實驗利用的是ELISA的夾心法。微孔中包被了羊抗兔抗體。在溫育時間之內(nèi)，加入的溶液抗在體可直接與抗原分子上的一個表位結合。樣品中的抗原與酶標二抗（可與抗原分子上的不同表位結合）在包被孔中溫育。加入底物液后，溶液所顯示的顏色強度與樣品中抗原的量成正比。樣品的結果可直接用標準曲線確定。

4、貯存與穩(wěn)定性

試劑盒和運輸環(huán)境和儲存環(huán)境溫度為2-8℃，避免熱源或太陽直射。樣品的儲存與穩(wěn)定性及試劑的準備將在相關章節(jié)中闡述。開封的試劑盒在有效期內(nèi)穩(wěn)定，前提是要將試劑盒用袋子密封并儲存于2-8℃的環(huán)境下。

5、樣品的采集與儲存

注意	人體內(nèi)的兒茶酚氨和間甲腎上腺素的釋放會受到一些食品和藥物的影響。因此在樣品采集前72小時內(nèi)病人應禁止服用下列食物和藥品：維生素B，咖啡，香蕉，α甲基多巴，MAO，COMT抑制劑，還有降血壓類藥物。

血漿（EDTA）

注意	血液采集后兩小時內(nèi)，將血液樣品冷藏于2-8℃的環(huán)境下直致離心獲取血漿。
注意靜脈穿刺采集全血的常規(guī)注意事項。從采集到血液樣品的那一刻起到檢測時都應保持血液樣品的化學整體性。不要使用明顯溶血、黃疸血和脂血樣品。如果樣品出現(xiàn)混濁，則在實驗前應當離心以除去所有的微粒物質(zhì)。
貯存	2-8℃	≤-20℃	避免熱源或太陽直射，避免反復凍融，冷凍狀態(tài)下運輸樣品。
穩(wěn)定性	6h	1個月

尿液

可以是自然尿液也可使用24h尿液。收集病人24h內(nèi)的所有尿液，之后將其加入到10-15ml 6N的HCl防腐劑中。
貯存	≤-20℃	避免熱源或太陽直射，避免反復凍融，冷凍狀態(tài)下運輸樣品。
穩(wěn)定性	6個月

6、試劑盒成分

注意	試劑盒所提供的試劑足夠做96孔單孔檢測或48孔雙份檢測。

注意	此包被板也可用于檢測腎上腺素、去甲腎上腺素和多巴胺。

數(shù)量	標志	成分
1×12×8	MTP	包被板，可拆，微孔中包被了抗兔IgG（羊，單克�。�。
1×6×2.5ml	CAL A-F	標準品A-F 腎上腺素:0;1.5;15;50;150ng/ml(0;8;27;82;273;819nmol/L) 去甲腎上素:0;5.0;15;50;150;500ng/mL(0;30;89;296;887;2955nmol/L) 多巴胺:0;12;35;115;450;2250ng/mL(0;78;228;750;2938;14688nmol/L) 即用,內(nèi)含:腎上腺素-去甲腎上腺素-多巴胺(具有生物活性),0.1M的HCl
1×2×2.5ml	CONTROL 1+2	質(zhì)控品1+2 即用,含: 腎上腺素-去甲腎上腺素-多巴胺(具有生物活性),0.1M的HCl,具體濃度及可允許范圍請見試劑瓶標簽.
1×250μL	ENZCONJ CONC	酶聯(lián)物濃縮型（100×）內(nèi)含：堿性磷酸酶標記的抗體，Tris緩沖液，HCl，0.01%的NaN3
4×	EXTRPLATE	提取板（微孔板）每板24孔，包被了硼酸親和凝膠。
2×60ml	EXTRBUF	提取緩沖液粉紅色，即用，內(nèi)含：0.016%的NaN3
1×1.25ml	COMT LYO	COMT凍干粉內(nèi)含：兒茶酚-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶（豬肝），NaN3
1×2ml	COMT ADD	COMT添加劑內(nèi)含：人血漿，穩(wěn)定劑，0.01%硫柳汞。
1×7ml	ANTISERUM DO	多巴胺抗血清紫羅蘭色，即用，內(nèi)含：抗多巴胺抗體（兔），緩沖液，穩(wěn)定劑。
2×1.25ml	COENZ	酶聯(lián)復合物即用，內(nèi)含：S-腺苷-L-蛋白酸，穩(wěn)定劑。
1×3ml	ENZBUF	酶緩沖液即用，內(nèi)含：Tris緩沖液，HCl，穩(wěn)定劑。
4×13ml	RELEASEBUF	Release緩沖液黃色，即用，內(nèi)含：0.1M的HCl，指示劑。
2×3ml	ACYLREAG	�；噭� 即用，內(nèi)含：二甲基甲酰胺，乙醇。注意：有毒，高可燃性。
2×50ml	WASHBUR CONC	洗滌液濃縮型（10×）內(nèi)含：Tris緩沖液，HCl，吐溫，0.2%的NaN3
1×9×	PNPP SUBS	PNPP底物片內(nèi)含：對硝基苯磷酸（PNPP）
1×27ml	PNPP BUF	PNPP底物緩沖液即用，內(nèi)含：二乙醇胺，水，0.05%的NaN3
1×15ml	PNPP STOP	PNPP終止液即用，內(nèi)含：1M的NaOH，0.25M的EDTA
1×20ml	HCl	HCl 即用，內(nèi)含：0.1M的HCl
3×	FOIL	粘性金屬板

7、實驗所需器材（但試劑盒不提供）

1）移液器（10；10-100；100-1000μL）

2）軌道搖床（200-900rpm）

3）旋渦混合器

4）帶儲器的8通道移液器

5）洗滌瓶，自動或半自動包被板清洗系統(tǒng)

6）酶標儀

7）雙蒸水或去離子水

8）吸水紙，取樣吸頭，計時器

9）樣品稀釋用試管。

8、手動操作

8.1實驗前說明

注意	用于96人份檢測色試劑盒成分可分成兩次進行。下列所述體積為做48人份時所需要的量。
注意	試劑盒中的質(zhì)控品和所有尿液樣品在使用前都必須在試管中用0.1M的HCl按1：5的比例進行稀釋（例如：20μL尿液+80μL 0.1M的HCl）。標準品無需稀釋。

8.2樣品的稀釋

如果樣品中多巴胺濃度高于最高標準品的應按照下列所述進行稀釋：

樣品	待稀釋	稀釋液	備注
血漿	多巴胺濃度高于最高標準品中多巴胺的濃度	雙蒸水	提取步驟前
尿液	多巴胺濃度高于最高標準品中多巴胺的濃度	0.1N的HCl	提取步驟前

8.3樣品、標準品和質(zhì)控品的提取（提取板）

1）	將標準品、已稀釋好的質(zhì)控品、已稀釋好的尿液樣品各20μL和500μL血漿樣品加入到提取板相應的微孔中。除血漿樣品孔外，在所有的微孔中加入500μL雙蒸水以消除體積差別。
2）	在每一微孔中加入1000μL提取緩沖液
3）	蓋板。在軌道搖床（600-900rpm）上18-25℃的環(huán)境下提取30min。在提取過程中，液體的表面應該會浸濕粘性金屬板，但液體的量不能超過微孔的2/3。液體是否濺出并不會影響實驗結果。
4）	移去粘性金屬板，快速棄取孔內(nèi)反應液，在吸水紙上拍干。
5）	每孔加入2ml雙蒸水
6）	用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上（600-900rpm）18-25℃的環(huán)境下振蕩5min。液體是否濺出并不會影響實驗結果。
7）	移去粘性金屬板，快速棄取孔內(nèi)反應液，在吸水紙上拍干。
8）	每孔加入150μL提取緩沖液，再向每孔中加入50μL�；噭�，立即混合均勻。
9）	在軌道搖床（400-600rpm）上18-25℃的環(huán)境下提取20min。（無需蓋板）
10）	快速棄取孔內(nèi)反應液，在吸水紙上拍干。
11）	每孔加入2ml雙蒸水。
12）	用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上（600-900rpm）18-25℃的環(huán)境下振蕩5min。液體是否濺出并不會影響實驗結果。
13）	移去粘性金屬板，快速棄取孔內(nèi)反應液，在吸水紙上拍干。
14）	每孔加入300μL Release緩沖液。
15）	在軌道搖床（400-500rpm）上18-25℃的環(huán)境下振蕩30min。（無需蓋板）

已準備好的樣品應當在當天就進行檢測。如果不行的話，您可將提取板用粘性金屬板蓋好，在2-8℃的環(huán)境下可存放一夜。

8.4凍干粉或濃縮成分的準備

稀釋	成分		稀釋液	比例	備注	貯存	穩(wěn)定性
25ml	洗滌液	225ml	雙蒸水	1:10	充分混合	2-8℃	4W
60μL	酶聯(lián)物	6ml	洗滌緩沖液（已稀釋好）	1:101	臨時配置，僅能使用一次，混合時避免氣泡產(chǎn)生	18-25℃	5h
4	PNPP底物片	10.7ml	PNPP底物液		臨時配置，僅能使用一次	18-25℃	5h

9、實驗步驟（手動操作）

9.1 COMT酶溶液的準備

注意：COMT酶溶液應在使用前直接臨時配置

在COMT凍干粉中加入1.25ml雙蒸水，充分混和。再加入1.25ml酶聯(lián)溶液，然后再加入1.25ml酶溶液和0.40ml COMT添加劑以充分混合溶解的COMT試劑*，COMT酶溶液最后的體積為每支4.15ml。一支可做48人份。溶液可用旋渦混合器混合，但要避免氣泡產(chǎn)生，配置好的COMT溶液可在室溫下穩(wěn)定存放1小時。

*如果只需要一定量的COMT溶液，則剩余的COMT溶液應立即凍存于-20℃的環(huán)境下。COMT溶液可在此環(huán)境下穩(wěn)定存放1-2個月。

9.2樣品、標準品和質(zhì)控品的酶化

注意	如果使用自動置換型移液器，請將取樣吸頭內(nèi)的殘余液體加回到提取板相應的微孔內(nèi)。將提取板置于一斜坡位置比較適當。

科研用組織勻漿和細胞培養(yǎng)上清可按如下建議處理：細胞培養(yǎng)上清必須根據(jù)其培養(yǎng)基及其相應濃度進行處理：根據(jù)尿液樣品的操作說明（至少提取20ul上清液），未稀釋樣品的靈敏度大概為1.0ng/ml。如果基質(zhì)內(nèi)添加了血清（FCS），血漿（至少提取500ul上清）操作的靈敏度可以是5pg/ml。無高氯酸的組織勻漿可用做勻漿樣品，具體信息請咨詢IBL漢堡公司。

9.3檢測尿液和血漿中的多巴氨

1	在包被板的每一微孔中加入75μL剛配置好的COMT酶溶液，輕輕振蕩。
2	在尿液樣品、標準品和質(zhì)控品的微孔中加入90μL Release緩沖液（血漿樣品孔除外）。將已提取好的標準品、質(zhì)控品和尿液樣品分別10μL加入到相應的微孔中。將100ul提取好的血漿樣品加入到相應的微孔中。在此加樣步驟中，可直接將取樣吸頭伸入到COMT溶液中。溶液顏色變成粉色，輕輕振蕩。
3	在每一微孔中加入50ul多巴胺抗血清（紫色）。
4	蓋板，在振蕩器（400-600rpm）上室溫（18-25℃）溫育120min
5	移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應液，每孔用250-300μL已稀釋好的洗滌液洗板6次。吸水紙上拍干以除去殘余液體。
6	在每一微孔中加入100ul臨時配置好的酶聯(lián)物。
7	蓋板，在振蕩器（400-600rpm）上室溫（18-25℃）溫育60min
8	移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應液，每孔用250-300μL已稀釋好的洗滌液洗板6次。吸水紙上拍干以除去殘余液體。
9	如果可以的話，使用8道移液器加底物液和終止液。加底物液和終止液的時間間隔應當相同，使用自動置換型移液器并避免氣泡產(chǎn)生。
10	在每一微孔中加入200ul底物液。
11	在振蕩器（400-600rpm）上室溫（18-25℃）溫育40min
12	在每一微孔中加入50ul PNPP終止液，輕輕振板以使溶液混合均勻。
13	加終止液后60min內(nèi)405nm處讀取OD值。（參考波長：620-650nm）

10、自動操作步驟

10.1實驗前說明

注意	用于96人份檢測色試劑盒成分可分成兩次進行。下列所述體積為做48人份時所需要的量。
注意	試劑盒中的質(zhì)控品和所有尿液樣品在使用前都必須在試管中用0.1M的HCl按1：5的比例進行稀釋（例如：20μL尿液+80μL0.1M的HCl）。標準品無需稀釋。

10.2樣品的稀釋

如果樣品中多巴胺濃度高于最高標準品的應按照下列所述進行稀釋：

樣品	待稀釋	稀釋液	備注
血漿	多巴胺濃度高于最高標準品中多巴胺的濃度	雙蒸水	提取步驟前
尿液	多巴胺濃度高于最高標準品中多巴胺的濃度	0.1N的HCl	提取步驟前

10.3樣品、標準品和質(zhì)控品的提�。ㄌ崛“澹�

1）	將標準品、已稀釋好的質(zhì)控品、已稀釋好的尿液樣品各30μL和750μL血漿樣品加入到提取板相應的微孔中。除血漿樣品孔外，在所有的微孔中加入750μL雙蒸水以消除體積差別。
2）	在每一微孔中加入1000μL提取緩沖液
3）	蓋板。在軌道搖床（600-900rpm）上18-25℃的環(huán)境下提取30min。在提取過程中，液體的表面應該會浸濕粘性金屬板，但液體的量不能超過微孔的2/3。液體是否濺出并不會影響實驗結果。
4）	移去粘性金屬板，快速棄取孔內(nèi)反應液，在吸水紙上拍干。
5）	每孔加入2ml雙蒸水
6）	用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上（600-900rpm）18-25℃的環(huán)境下振蕩5min。液體是否濺出并不會影響實驗結果。
7）	移去粘性金屬板，快速棄取孔內(nèi)反應液，在吸水紙上拍干。
8）	每孔加入150μL提取緩沖液，再向每孔中加入50μL酰化試劑，立即混合均勻。
9）	在軌道搖床（400-600rpm）上18-25℃的環(huán)境下提取20min。（無需蓋板）
10）	快速棄取孔內(nèi)反應液，在吸水紙上拍干。
11）	每孔加入2ml雙蒸水。
12）	用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上（600-900rpm）18-25℃的環(huán)境下振蕩5min。液體是否濺出并不會影響實驗結果。
13）	移去粘性金屬板，快速棄取孔內(nèi)反應液，在吸水紙上拍干。
14）	每孔加入450μL Release緩沖液。
15）	在軌道搖床（400-500rpm）上18-25℃的環(huán)境下振蕩30min。（無需蓋板）

已準備好的樣品應當在當天就進行檢測。如果不行的話，您可將提取板用粘性金屬板蓋好，在2-8℃的環(huán)境下可存放一夜。

10.4凍干粉或濃縮成分的準備

稀釋	成分		稀釋液	比例	備注	貯存	穩(wěn)定性
25ml	洗滌液	450ml	雙蒸水	1:10	充分混合	2-8℃	4W
150μL	酶聯(lián)物	15ml	洗滌緩沖液（已稀釋好）	1:101	臨時配置，僅能使用一次，混合時避免氣泡產(chǎn)生	18-25℃	5h
4	PNPP底物片	10.7ml	PNPP底物液		臨時配置，僅能使用一次	18-25℃	5h

11、實驗步驟（自動操作）

11.1 COMT酶溶液的準備

注意：COMT酶溶液應在使用前直接臨時配置

*如果只需要一定量的COMT溶液，則剩余的COMT溶液應立即凍存于-20℃的環(huán)境下。COMT溶液可在此環(huán)境下穩(wěn)定存放1-2個月。

11.2實驗步驟

在使用自動方法做實驗時，我們建議按1：10的比例預先稀釋提取好的標準品、質(zhì)控品和尿液樣品（如果是手動操作則用Release緩沖液進行稀釋）。如果稀釋了，第二個步驟可簡化為：將已提取好的血漿樣品、已提取好的標準品（按1：10的比例預先稀釋）、質(zhì)控品和尿液樣品各100μL加入到微孔中。在進行預稀釋時，應當考慮到自動操作的死容積。

1）在包被板的每一微孔中加入75μL剛配置好的COMT酶溶液，輕輕振蕩。

2）在尿液樣品、標準品和質(zhì)控品的微孔中加入90μL Release緩沖液（血漿樣品孔除外）。將已提取好的標準品、質(zhì)控品和尿液樣品分別10μL加入到相應的微孔中。在此加樣步驟中，可直接將取樣吸頭伸入到COMT溶液中。溶液顏色變成粉色，輕輕振蕩。

3）每孔中加入50μL多巴胺抗血清。

4）蓋板。在振蕩器（400-600rpm）上18-25℃的環(huán)境下溫育120min

5）棄取孔內(nèi)反應液，每孔用250-300μL已稀釋好的洗滌液洗板6次。

6）每孔加入100μL酶聯(lián)物

7）蓋板。在軌道搖床（400-600rpm）上18-25℃的環(huán)境下溫育60min

8）棄取孔內(nèi)反應液，用250-300μL已稀釋好的洗滌液洗板6次。

9）加底物液和終止液時，其時間間隔應相同

10）每孔加入200μL底物液

11）在軌道搖床（400-600rpm）上18-25℃的環(huán)境下溫育40min。如果自動操作時的溫度超過25℃時，則應相應的將溫育時間縮短至30min。

12）每孔加入50μL PNPP終止液以終止底物反應，輕輕振蕩包被板以充分混合試劑成分。