遺傳標(biāo)記在遺傳學(xué)的建立和發(fā)展過程中有著舉足輕重的作用，隨著遺傳學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展和分子生物學(xué)的異軍突起，遺傳標(biāo)記先后相應(yīng)地經(jīng)歷了形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記和DNA分子標(biāo)記四個發(fā)展階段。前三種標(biāo)記都是以基因表達(dá)的結(jié)果為基礎(chǔ)的，是對基因的間接反映；而DNA分子標(biāo)記則是DNA水平遺傳變異的直接反映，它具有能對各個發(fā)育時期的個體、各個組織、器官甚至細(xì)胞作出“中性”以及操作簡便等特點(diǎn)。正是這些特點(diǎn)，奠定了它極其廣泛的應(yīng)用基礎(chǔ)。DNA分子標(biāo)記本質(zhì)上是指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異的特異特DNA片段^[1]。DNA分子標(biāo)記大多以電泳譜帶的形式表現(xiàn)生物個體之間DNA差異，通常也稱為DNA的指紋圖譜。在過去10多年中，分子標(biāo)記技術(shù)得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，至今已有幾十種分子標(biāo)記技術(shù)相繼出現(xiàn)，并在基因庫構(gòu)建、基因克隆、基因組作圖、基因定位、作物遺傳育種、植物親緣關(guān)系鑒別等各個研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

 

    1980年Botesin提出的限制性片段長度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphisms ，RFLP)可以作為遺傳標(biāo)記，開創(chuàng)了直接應(yīng)用DNA多態(tài)性的新階段，是最早應(yīng)用的分子標(biāo)記技術(shù)^[2]。RFLP是檢測DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小，反映DNA分子上不同酶切位點(diǎn)的分布情況，因此DNA序列上的微小變化，甚至1個核苷酸的變化，也能引起限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)的丟失或產(chǎn)生，導(dǎo)致酶切片段長度的變化。RFLP標(biāo)記的等位基因具有共顯性的特點(diǎn)，結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，特別適應(yīng)于構(gòu)建遺傳連鎖圖。但是，在進(jìn)行RFLP分析時，需要該位點(diǎn)的DNA片段做探針，用放射性同位素及核酸雜交技術(shù)，既不安全又不易自動化。另外，RFLP對DNA多態(tài)性檢出的靈敏度不高，RFLP連鎖圖上還有很多大的空間區(qū)^[3]。

 

    為了克服RFLP技術(shù)上的缺點(diǎn)，Williams等^[4]于1990年建立了隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(Randomamplified polymorphic DNA ，RAPD)技術(shù)，由于其獨(dú)特的檢測DNA多態(tài)性的方式使得RAPD技術(shù)很快滲透于基因研究的各個領(lǐng)域。RAPD是建立于PCR基礎(chǔ)之上的分子標(biāo)記技術(shù)，基本原理是利用一個隨機(jī)引物(8～10個堿基)通過PCR反應(yīng)非定點(diǎn)地擴(kuò)增DNA片段，然后用凝膠電泳分離擴(kuò)增片段來進(jìn)行DNA多態(tài)性研究^[5]。對任一特定引物而言，它在基因組DNA序列上有其特定的結(jié)合位點(diǎn)，一旦基因組在這些區(qū)域發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變，就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點(diǎn)的分布發(fā)生變化，從而導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量和大小發(fā)生改變，表現(xiàn)出多態(tài)性。與RFLP相比，RAPD技術(shù)簡單，檢測速度快，DNA用量少，實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡單，不需DNA探針，設(shè)計引物也不需要預(yù)先克隆標(biāo)記或進(jìn)行序列分析，不依賴于種屬特異性和基因組的結(jié)構(gòu)，合成一套引物可以用于不同生物基因組分析，用一個引物就可擴(kuò)增出許多片段，而且不需要同位素，安全性好。當(dāng)然，RAPD技術(shù)受許多因素影響，實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性差^[6]，首先是顯性遺傳，不能識別雜合子位點(diǎn)，這使得遺傳分析相對復(fù)雜^[7]，在基因定位、作連鎖遺傳圖時，會因顯性遮蓋作用而使計算位點(diǎn)間遺傳距離的準(zhǔn)確性下降;其次，RAPD對反應(yīng)條件相當(dāng)敏感，包括模板濃度、Mg2+濃度，所以實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差^[8]。

 

    擴(kuò)增片段長度多態(tài)技術(shù)(AFLP)，又名限制片段選擇擴(kuò)增技術(shù)(Selective restriction fragment amplifi2cation ，SRFA)，于1993年由荷蘭KEYGENE公司的Zabean和Vos等發(fā)明^[9]，并已申請專利。AFLP是近年來迅速發(fā)展起來的一種分子標(biāo)記技術(shù)，它將基因組DNA用成對的限制性內(nèi)切酶雙酶切后產(chǎn)生的片段用接頭(與酶切位點(diǎn)互補(bǔ))連接起來，并通過5′端與接頭互補(bǔ)的半特異性引物擴(kuò)增得到大量DNA片段，從而形成指紋圖譜的分子標(biāo)記技術(shù)。AFLP指紋呈孟德爾式共顯性和顯隱性遺傳。它兼具RAPD與RFLP的優(yōu)點(diǎn)，有較高的穩(wěn)定性，用少量的選擇性引物能在較短時間內(nèi)檢測到大量位點(diǎn)，并且每對引物所檢測到的多個位點(diǎn)都或多或少地隨機(jī)分布在多條染色體上，各染色體上AFLP標(biāo)記的數(shù)目與染色體長度呈正相關(guān)(r =0.501)，而一對引物獲得的標(biāo)記涉及的染色體數(shù)與標(biāo)記數(shù)呈正相關(guān)(r =0.826)。因此，通過少量效率高的引物組合，可獲得覆蓋整個基因組的AFLP標(biāo)記^[10]。目前，AFLP作為一種高效的指紋技術(shù)，已在遺傳育種研究中發(fā)揮它的優(yōu)勢^[11]。不過也有研究認(rèn)為，AFLP對基因組純度和反應(yīng)條件要求較高^[12]，另外用于遺傳作圖時，少數(shù)的標(biāo)記與圖譜緊密度有出入。此外，在RAPD和RFLP技術(shù)基礎(chǔ)上建立了SCAR(Sequence characterizedamplified regions ，序列特異性擴(kuò)增區(qū)域)、CAPS(Cleaved ampli2fied polymorphic sequence ，酶切擴(kuò)增多態(tài)序列)和DAF(DNA amplified fingerprints ，DNA擴(kuò)增指紋)等標(biāo)記技術(shù)^[13]。這些技術(shù)的出現(xiàn)，進(jìn)一步豐富、完善了第1代分子標(biāo)記技術(shù)，增加了人們對DNA多態(tài)性的研究手段。

 

    在真核生物基因組中存在許多非編碼的重復(fù)序列，如重復(fù)單位長度在15～65個核苷酸的小衛(wèi)星DNA(Minisatellite DNA)，重復(fù)單位長度在2～6個核苷酸的微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)。小衛(wèi)星和微衛(wèi)星DNA分布于整個基因組的不同位點(diǎn)。由于重復(fù)單位的大小和序列不同以及拷貝數(shù)不同，從而構(gòu)成豐富的長度多態(tài)性。Moore等于1991年結(jié)合PCR技術(shù)創(chuàng)立了SSR(Simple sequence repeat，簡單重復(fù)序列)標(biāo)記技術(shù)。SSR也稱微衛(wèi)星DNA，是一類由幾個(多為1～5個)堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，其中最常見的是雙核苷酸重復(fù)，即(CA)n和(TG)n ，每個微衛(wèi)星DNA的核心序列結(jié)構(gòu)相同，重復(fù)單位數(shù)目10～60個，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。不同遺傳材料重復(fù)次數(shù)不同，導(dǎo)致了SSR 長度的高度變異性，這一變異性正是SSR標(biāo)記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。SSR標(biāo)記的基本原理是根據(jù)微衛(wèi)星重復(fù)序列兩端的特定短序列設(shè)計引物，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段。由于核心序列重復(fù)數(shù)目不同，因而擴(kuò)增出不同長度的PCR產(chǎn)物，這是檢測DNA多態(tài)性的一種有效方法。微衛(wèi)星序列在群體中通常具有很高的多態(tài)性，而且一般為共顯性，因此是一類很好的分子標(biāo)記。

 

2.2 ISSR 標(biāo)記技術(shù)

    ISSR即內(nèi)部簡單重復(fù)序列，是一種新興的分子標(biāo)記技術(shù)。1994年Zietkiewicz等對SSR技術(shù)進(jìn)行了發(fā)展，建立了加錨微衛(wèi)星寡核苷(Anchored-microsatellite-oligonucleotides)技術(shù)^[14]。他們用加錨定的微衛(wèi)星寡核苷酸作引物，即在SSR的5′端或3′端加上2～4個隨機(jī)選擇的核苷酸，這可引起特定位點(diǎn)退火，從而導(dǎo)致與錨定引物互補(bǔ)的間隔不太大的重復(fù)序列間的基因組節(jié)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這類標(biāo)記又被稱為ISSR(Inter simple sequence repeat)、ASSR(Anchored simple sequence repeats)^[15]或AMP PC^R[16]。在所用的兩翼引物中，可以一個是ASSR引物，另一個是隨機(jī)引物。如果一個是5′端加錨的ASSR引物，另一個是隨機(jī)引物，則被稱為RAMP技術(shù)^[17]。

 

    單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotidepolymorphism，SNP)被稱為第3代DNA分子標(biāo)記，是指同一位點(diǎn)的不同等位基因之間個別核苷酸的差異，這種差異包括單個堿基的缺失或插入^[18]，更常見的是單個核苷酸的替換，且常發(fā)生在嘌呤堿基(A與G)和嘧啶堿基(C與T)之間。SNP標(biāo)記可幫助區(qū)分兩個個體遺傳物質(zhì)的差異，被認(rèn)為是應(yīng)用前景最好的遺傳標(biāo)記。目前，已有2000多個標(biāo)記定位于人類染色體上，在擬南芥上也已發(fā)展出236個SNP標(biāo)記。在這些SNP 標(biāo)記中大約有30%包含限制性位點(diǎn)的多態(tài)性。檢測SNP的最佳方法是DNA芯片技術(shù)，最新報道的微芯片電泳(Microchip electrophoresis)，可以高速度地檢測臨床樣品的SNP，它比毛細(xì)管電泳和板電泳的速度可分別提高10 和50倍^[19]。SNP與第1代的RFLP及第2代的SSR標(biāo)記的不同有2個方面:其一，SNP不再以DNA片段的長度變化作為檢測手段，而直接以序列變異作為標(biāo)記;其二，SNP標(biāo)記分析完全摒棄了經(jīng)典的凝膠電泳，代之以最新的DNA芯片技術(shù)。

 

    表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed sequence Tag ，EST)是美國國立衛(wèi)生研(National Institutes of Health ，NIH)的生物學(xué)家Venter于1991年提出的^[20]。隨著人類基因組計劃的開展，EST技術(shù)首先被廣泛應(yīng)用于尋找人類新基因，繪制人類基因組圖譜，識別基因組序列編碼區(qū)等研究領(lǐng)域，之后又被廣泛應(yīng)用于植物基因組研究^[21]。EST是指在來源于不同組織的cDNA文庫中隨機(jī)挑選克隆、測序，得到部分cDNA序列，一個EST對應(yīng)于某一種mRNA的cDNA克隆的一段序列，長度一般為150～500bp，只含有基因編碼區(qū)域。EST可代表生物體某種組織某一時間的一個表達(dá)基因，所以被稱之為“表達(dá)序列標(biāo)鑒”;而EST的數(shù)目則顯示出其代表的基因表達(dá)的拷貝數(shù)，一個基因的表達(dá)次數(shù)越多，其相應(yīng)的cDNA克隆越多，所以通過對cDNA克隆的測序分析可以了解基因的表達(dá)豐度^[22]。目前構(gòu)建cDNA文庫一般都使用試劑盒，方法成熟，而且飛速發(fā)展的DNA測序技術(shù)，也使得進(jìn)一步降低大規(guī)模DNA序列測定成本成為可能^[23]。

 

    RGAs是用基于抗病基因保守序列設(shè)計的引物擴(kuò)增基因組得到的抗病基因類似序列的新型的分子標(biāo)記。盡管基因間整個序列的同源性不足于用RFL P 雜交檢測，但抗病基因中存在的這些保守區(qū)域?yàn)樵谄渌�植物中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和分離RGAs 提供了機(jī)會^[24]。

 

    利用RAPD引物和微衛(wèi)星上游或下游引物結(jié)合，對基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，探索更有效的揭示所有微衛(wèi)星及其他DNA遺傳多態(tài)性的方法，以期獲得研究DNA多態(tài)性的新的分子標(biāo)記方法。因該方法同時利用隨機(jī)引物和微衛(wèi)星引物進(jìn)行擴(kuò)增，暫時定名為隨機(jī)微衛(wèi)星擴(kuò)增多態(tài)DN^A[25]。

 

    SRAP標(biāo)記是基于PCR技術(shù)的新型分子標(biāo)記技術(shù)，其原理是利用基因外顯子里G、C 含量豐富，而啟動子和內(nèi)含子里A、T含量豐富的特點(diǎn)設(shè)計兩套引物，對開放閱讀框架進(jìn)行擴(kuò)增。此技術(shù)具有簡便、穩(wěn)定、中等產(chǎn)率和容易得到選擇條帶序列的特點(diǎn)，在基因組中分布均勻，適合于不同作物的基因定位、基因克隆和遺傳圖譜構(gòu)建^[26]。

 

    TRAP是由HUJ G等于2003年從SRAP技術(shù)改進(jìn)而來的新型分子標(biāo)記技術(shù)，其原理是借助大規(guī)模測序技術(shù)產(chǎn)生的龐大生物序列信息，利用生物信息學(xué)工具和表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫信息設(shè)計引物，對目標(biāo)候選基因序列區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)生多態(tài)性標(biāo)記。此標(biāo)記具有操作簡單、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好、效率高的特點(diǎn)。目前已經(jīng)成功應(yīng)用于許多植物的遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀基因標(biāo)記、種質(zhì)資源的多樣性研究及分子標(biāo)記輔助育種等方面^[26]。