Lightscanner 和Lightscanner32 非標(biāo)記探針?lè)ɑ�因分�?BR>載脂蛋白（ApoE）多重實(shí)驗(yàn)

密碼子112（T>C）
密碼子158（C>T）

實(shí)驗(yàn)背景

      載脂蛋白（ApoE）是一種糖蛋白，包括299個(gè)氨基酸，在身體調(diào)節(jié)膽固醇水平上起主要作用。膽固醇水平過(guò)高是冠心病的主要因素，在美國(guó)，冠心病是引起死亡的主要因素。ApoE與老年癡呆癥也有關(guān)系，這種病是因?yàn)榇竽X額葉萎縮，造成神經(jīng)衰弱。老年癡呆癥的普遍表現(xiàn)是癡呆，而且是不能治愈、退化、終端的。ApoE基因有兩個(gè)SNPs，位于密碼子112（c.388 T>C）和158（c.526 C>T）。密碼子112和158組合的基因型翻譯3種不同類(lèi)型的蛋白質(zhì)，通常稱(chēng)為：ε3（正常），ε2（異常），和ε4（異常）。
      
                     
• ε2等位基因與高脂蛋白血癥遺傳缺陷類(lèi)型Ⅲ相連鎖，增加或減少動(dòng)脈硬化的風(fēng)險(xiǎn)。
• 在群體中，近似于64%的人有ε3等位基因，此等位基因被認(rèn)為是“中性”的ApoE基因型。
• ε4等位基因與動(dòng)脈硬化和老年癡呆癥有關(guān)系，損害認(rèn)知功能，減少神經(jīng)突分支。

方法

      基因分型的同類(lèi)PCR方法一般需要熒光標(biāo)記的核苷酸探針，我們用3’端封閉的，非標(biāo)記探針（Luna Probes）及LC Green飽和染料生成探針下基因型特有的熔解曲線。此方法的關(guān)鍵是不平衡PCR引物的比例，此比例導(dǎo)致不對(duì)稱(chēng)PCR或過(guò)量產(chǎn)生一條單鏈（實(shí)驗(yàn)中探針的目的鏈），這樣才可以生成足夠的信號(hào)。
       需要以下的試劑建立成功來(lái)得Lightscanner儀器。

準(zhǔn)備樣品

      高分辨率熔解曲線（HRM）對(duì)比的是獨(dú)立的PCR反應(yīng)的熔解圖，因此，將反應(yīng)之間的變化最小化是非常關(guān)鍵的。要用HRM分析的樣品必須用相同的提取平臺(tái)提取。這樣就排除了不同提取平臺(tái)最后洗脫buffer之間的試劑組成的微小不同。做HRM實(shí)驗(yàn)，建議10ul體系基因組DNA模板的含量是10-20ng。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

注：帶下劃線的紅色字體顯示的是SNP位點(diǎn)在非標(biāo)記探針中的位置�！癰lock”顯示的是C3封閉，阻止
探針的3’端延伸。 根據(jù)112探針的小的特征，設(shè)計(jì)其與目的鏈錯(cuò)配來(lái)改變探針的Tm值。這樣允許在同
一反應(yīng)中，112和158探針的溫度有差異。                                              

反應(yīng)體系

96孔板操作

按照以下步驟操作：
1. 在每個(gè)孔中加25 μL礦物油。
2. 將沒(méi)有模板的PCR混合液加入每個(gè)孔（9 μL）。
3. 加入DNA模板（每個(gè)孔1 μL）。
4. 用封口膜封閉96孔板。
5. 2000-3000rpm離心，至少1分鐘。
      將96孔板放入PCR儀。

擴(kuò)增Protocol（模塊加熱）

在Lightscanner儀器上掃描樣品，運(yùn)行以下熔解參數(shù)：
起始溫度：50℃；結(jié)束溫度：97℃；自動(dòng)曝光。

擴(kuò)增Protocol（LS32）

基因分型結(jié)果（Lightscanner）

基因分型結(jié)果（Lightscanner32）

 
參考文獻(xiàn)
Poulson MD, Wittwer CT. Closed-tube genotyping of apolipoprotein E by isolated-probe PCR with multiple unlabeled probes and high-resolution DNA melting analysis, Biotechniques. 2007;43(1):87–91.