用于檢測和定量分析極性細(xì)胞代謝物的一種新穎的HILIC LC-MS方法
用于檢測和定量分析極性細(xì)胞代謝物的一種新穎的HILIC LC-MS方法
Henry Shion1、John Shockcor1、Evan Bernier2、Stephen Mcdonald2、Kirsten Hartil3、Bhavapriya Vaitheesvaran3、Haitao Lu3、Gustavo Palacios3、Inwin J. Kurland3、Alan L. Millar1
1沃特世公司，美國馬薩諸塞州米爾福德；2沃特世公司，美國馬薩諸塞州貝弗利；3猶太大學(xué)阿爾伯特Ÿ愛因斯坦醫(yī)學(xué)院，美國紐約市布朗克斯區(qū)
引言
復(fù)雜生物樣品通常包含大量可反映有機(jī)體代謝狀態(tài)的內(nèi)源性代謝物。特別是骨骼肌可根據(jù)其是快收縮肌（白色肌肉，糖酵解型）還是慢收縮肌（紅色肌肉，氧化型）而表現(xiàn)出特征性的代謝組“指紋圖譜”。例如，紅色肌肉應(yīng)顯示一種富含線粒體代謝物（如三羧酸循環(huán)）的代謝組指紋圖譜；而白色肌肉應(yīng)顯示富含糖酵解代謝物的代謝組指紋圖譜，其線粒體代謝物的濃度大大低于紅色肌肉。雖然很多這類代謝物可具有較強(qiáng)的極性，但這些樣本通常使用反相液相色譜-質(zhì)譜（RP-LC-MS）進(jìn)行分析，由此而來的多是較差的保留。在本研究中，我們開發(fā)了一種用于檢測和定量強(qiáng)極性細(xì)胞代謝物的新穎LC-MS方法。本研究采用了基于亞2微米顆粒BEH酰胺柱的親水作用液相色譜（HILIC），并聯(lián)用了雜化四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀和三重四極桿質(zhì)譜。
方法
這些試驗(yàn)借助聯(lián)用了沃特世SynaptTM HDMSTM、沃特世Synapt G2 HDMS和Xevo TQ的一臺UPLC系統(tǒng)而進(jìn)行：
液相色譜條件（1）：使用堿性流動相
液相色譜系統(tǒng)：沃特世ACQUITY UPLC®系統(tǒng)
－ 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide 酰胺基柱，2.1×100mm，1.7µm
－ 柱溫：45℃
－ 流速：500µL／分鐘
－ 堿性流動相A：乙腈／水，95/5（v/v），10mM醋酸銨，pH=9.0
－ 堿性流動相B：乙腈／水，50/50（v/v），10mM醋酸銨，pH=9.0
－ 梯度（采用堿性流動相進(jìn)行分離時(shí)）：線性梯度，先用2% B - 85% B洗脫8分鐘，然后在98% B的水平下保持2分鐘，接著返回到2% B的水平進(jìn)行再平衡（5分鐘）
－ 進(jìn)樣量：5-20µL
液相色譜條件（2）：使用酸性流動相
液相色譜系統(tǒng)：沃特世®ACQUITY UPLC®系統(tǒng)
－ 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide 酰胺基柱，2.1×100mm，1.7µm
－ 柱溫：40℃
－ 流速：600µL／分鐘
－ 酸性流動相A：乙腈／水，95/5（v/v），10mM醋酸銨，pH=3.0
－ 酸性流動相B：水，10mM醋酸銨，pH=3.0
－ 梯度：先用5% B - 30% B洗脫5分鐘，在第5.5min時(shí)升至60% B并保持7分鐘，接著返回到5% B的水平進(jìn)行再平衡（5分鐘）
－ 進(jìn)樣量：20µL滿定量環(huán)
質(zhì)譜分析
Synapt HDMS和Synapt G2 HDMS
該質(zhì)譜儀在正離子MSE模式下運(yùn)行。所用的毛細(xì)管電壓為3.0kV，源溫度和去溶劑化溫度分別被設(shè)定為120℃和400℃。
在MSE采集模式下，儀器交替在低、高碰撞能量狀態(tài)下進(jìn)行交替掃描。這樣可在一次分析內(nèi)同時(shí)收集所有分析物的母離子和碎片離子的信息，消除了諸如DDA等其它常規(guī)方法所帶來的采樣偏差；在常規(guī)方法中，特定的m/z必須在碎片化前被分離出來。
Xevo-TQ質(zhì)譜
Xevo TQ可同時(shí)在正離子和負(fù)離子模式下運(yùn)行。毛細(xì)管電壓為3.0kV，源溫度和去溶劑化溫度分別被設(shè)定為150℃和650℃。去溶劑化氣體流速被設(shè)定為1200L／小時(shí)，碰撞氣體（氬）的流速為0.18mL／分鐘（4×10-3毫巴）。MS1/MS2分辨率被設(shè)置為單位質(zhì)量（0.75Da FWHM）。
組織提取物的樣品制備
紅色的比目魚�。⊿）用來與白色的腓腸�。℅）進(jìn)行比較，肌肉從禁食一整夜的BALB/c小鼠中切下并進(jìn)行了急速冷凍。代謝物通過組織均質(zhì)化的方法在1:1的甲醇：水混合溶劑中進(jìn)行萃取，脂質(zhì)通過將氯仿以1:1的比例添加至甲醇／水萃取液中而得到去除。去脂質(zhì)后的組織萃取樣本分別用400µL和4000µL的90:10乙腈：水混合溶劑進(jìn)行揮干復(fù)溶。由于某些組分的含量高于定量上限，因此也對每份樣本再稀釋10倍進(jìn)行了分析。
結(jié)果和討論
1. 通過聯(lián)用Synapt HDMS的UPLC進(jìn)行HILIC LC-MS方法開發(fā)
圖1. 108種標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)極性細(xì)胞代謝物的總離子色譜圖，其中包括氨基酸、DNA/RNA堿基及其磷酸鹽、輔酶A、B族維生素、有機(jī)酸等。
圖1給出了108種標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)極性細(xì)胞代謝物的總離子色譜圖（TIC），其中包括氨基酸、DNA/RNA堿基及其磷酸鹽、輔酶A、B族維生素、有機(jī)酸等。此項(xiàng)試驗(yàn)通過聯(lián)用沃特世Synapt HDMS（正離子MSE模式下）的沃特世UPLC【液相色譜條件（1）】而進(jìn)行。
圖2. 單一化合物提取離子色譜圖示例（50mDa窗口內(nèi)）
圖2給出了關(guān)于單一化合物提取離子色譜圖片段（50mDa窗口）的一些例子。所選取的提取離子色譜圖中的大部分峰寬測定值介于5-15秒之間。然而，也觀察到了拖尾峰，其峰寬長達(dá)60秒。因此，我們考慮修改液相色譜的條件。
2. 使用UPLC／Xevo-TQ聯(lián)用儀器對HILIC LC-MS方法開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)品和細(xì)胞萃取物進(jìn)行定量分析
在UPLC優(yōu)化過程中進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)品分析表明使用酸性pH的流動相緩沖液可提高對氨基酸和有機(jī)酸的分辨率、信噪比和峰對稱性。圖3比較了對一種包含約2µg/mL L-賴氨酸的純氨基酸溶液所得出的兩幅MRM色譜圖。靠上的色譜圖通過使用堿性流動相（液相色譜條件1）所進(jìn)行的分離而得出，而靠下的色譜圖則采用酸性流動相（液相色譜條件2）。
圖3. 比較不同pH下，包含約2µg/mL L-賴氨酸溶液的兩幅MRM色譜圖
圖4. 液相色譜條件（2）得出的MRM色譜圖示例
圖4將酸性流動相（液相色譜條件（2））下1600ng/mL校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品（上圖）和樣本H-S（0090）的MRM色譜圖進(jìn)行了疊加。
在此條件下，我們成功分離并定量分析了28種化合物，其中包括氨基酸、有機(jī)酸和磷酸鹽（圖6）。
圖5. TargetLynx給出的ADP電子報(bào)告示例
43種化合物的定量分析（既包括酸性也包括堿性條件）使用TargetLynxTM進(jìn)行。對于每種化合物，均生成了相應(yīng)的電子報(bào)告；計(jì)算結(jié)果通過線性回歸進(jìn)行確定。圖5是腺苷二磷酸（ADP，在三羧酸循環(huán)中特別重要）的一個(gè)報(bào)告示例。
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
圖6. 使用堿性（左表）和酸性（右表）流動相在H-S和H-G組織樣本中所檢出化合物的濃度計(jì)算結(jié)果總合
對在堿性和酸性流動相分離中所檢出的H-S和H-G組織樣本中的每種化合物均計(jì)算了分析物濃度。通過比較紅色比目魚�。⊿）和腓腸肌（G）組織樣本中的代謝物濃度證實(shí)了在其相對濃度方面存在顯著差異。
3. 通過聯(lián)用Synapt G2的UPLC對HILIC LC-MS方法的標(biāo)準(zhǔn)品和細(xì)胞萃取物進(jìn)行定量分析
最近開發(fā)的用于Synapt G2的QuanTof技術(shù)[1]以及MSE數(shù)據(jù)采集技術(shù)的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了一種通用型UPLC-MS方法的開發(fā)；這種方法可在一次運(yùn)行分析得到提供所有物質(zhì)的定量和定性信息，既包括母離子信息也包括產(chǎn)物離子的信息。對于此項(xiàng)測定而言，系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)品以及H-S和H-G樣本的數(shù)據(jù)都進(jìn)行了采集（圖7），所有的數(shù)據(jù)處理工作在采集完成后進(jìn)行。
圖7. 全掃描色譜圖比較。通過UPLC-Synapt G2獲取的S和G細(xì)胞萃取物的數(shù)據(jù)。
圖8. 目標(biāo)化合物的鑒定和定量結(jié)果
首先，自動篩選細(xì)胞萃取物中是否存在目標(biāo)化合物。離子的鑒定和確認(rèn)通過一個(gè)單一處理步驟使用Posit±veTM軟件包得出母離子和子離子的準(zhǔn)確質(zhì)量（2mDa窗口）而實(shí)現(xiàn)（圖8）。
該數(shù)據(jù)表明與Xevo TQ分析結(jié)果具有良好的一致性。圖8給出了一個(gè)示例，化合物L(fēng)-脯氨酸在細(xì)胞萃取物中被明確鑒別出來，并在4個(gè)數(shù)量級中表現(xiàn)出線性的動態(tài)范圍響應(yīng)，RMS質(zhì)量誤差為0.57mDa。
結(jié)論
使用新型BEH Amide酰胺柱可開發(fā)出一種用于分離極性組織細(xì)胞代謝物的HILIC LC-MS方法，總運(yùn)行時(shí)間不到15分鐘。
同時(shí)采用Xevo TQ和Synapt G2 HDMS對紅色和白色的肌肉組織萃取物進(jìn)行定量分析，可明顯區(qū)分出其主要代謝物（比如AMP、ADP和ATP、以及瓜氨酸）的顯著不同。
QuanTof技術(shù)實(shí)現(xiàn)了定性和定量試驗(yàn)?zāi)軌蛟赟ynapt G2上同時(shí)進(jìn)行。
參考文獻(xiàn)
1. Wildgoose J．整合了基于ADC新穎檢測技術(shù)的高效、幾何折疊型OA-Tof 質(zhì)量分析儀．第18屆國際質(zhì)譜大會（IMSC）所提交的公告，德國不來梅，2009年。
- ICP-MS測定土壤和沉積物中重金屬的不同前處理方法對比研究
- AFADESI-Orbitrap助力癌癥代謝機(jī)制研究，加速精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)
- 賽默飛無機(jī)質(zhì)譜技術(shù)在測量同位素比值中的應(yīng)用
- 聯(lián)用質(zhì)譜助力生物制藥質(zhì)控升級，毫克級電荷異構(gòu)體制備新突破
- 輝光放電質(zhì)譜法助力高純度固體無機(jī)樣品的快速痕量元素分析
- 賽默飛Stellar質(zhì)譜儀在血漿蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用
- 賽默飛獸藥篩查高分辨色譜質(zhì)譜方案升級助力食品安全
- 賽默飛TSQ Plus系列液質(zhì)聯(lián)用儀助力多肽及核酸藥物定量分析
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com