許　川1/舒為群1,��/張　亮1/曹　佳2/周　新3

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室, 重慶　400038； 2. 第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院軍事毒理學(xué)教研室，重慶　400038；3. 第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院燒傷科， 重慶　400038)

 

 

XU Chuan1, SHU Wei-qun1,��, ZHANG Liang1, CAO Jia2, ZHOU Xin3

(1. Department of Environmental Hygiene, School of Military Preventive Medicine, Third Military Medical University, Chongqing 400038; 2. Department of Toxicology, School of Military Preventive Medicine, Third Military Medical University, Chongqing 400038; 3.Institute of Burn Research， Southwestern Hospital，Third Military Medical University, Chongqing 400038,China)

 

　　【摘要】 背景與目的： 探討大鼠卵巢高純度顆粒細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定的方法，建立一種簡(jiǎn)便、穩(wěn)定的細(xì)胞模型。材料與方法： 選用SD雌性大鼠(21～25 d)，皮下注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)，48 h后用頸椎脫臼法處死，剖取雙側(cè)卵巢，采用機(jī)械分離方法釋放卵巢顆粒細(xì)胞，0.25％胰蛋白酶消化結(jié)合低速離心分離細(xì)胞，用含15％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37 ℃，5％ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。以HE染色和卵泡刺激素受體(FSHR)免疫組化染色對(duì)所培養(yǎng)的卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行鑒定，用MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，并檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液雌二醇(E2)和孕酮(P)的分泌量。 結(jié)果： 分離培養(yǎng)的卵巢顆粒細(xì)胞存活率>90％，細(xì)胞純度達(dá)到95％以上；體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為48～96 h；顆粒細(xì)胞具有正常的分泌雌激素功能，在培養(yǎng)24 h細(xì)胞培養(yǎng)液中E2和P的分泌量分別為(10.36±15.89) pg/ml和(77.91± 17.24) pg/ml。 結(jié)論： 采用機(jī)械分離法結(jié)合胰蛋白酶消化及低速離心法分離培養(yǎng)的卵巢顆粒細(xì)胞純度高、活性好，用FSHR表達(dá)染色鑒定顆粒細(xì)胞是一種簡(jiǎn)便快速的方法。

　　【關(guān)鍵詞】 大鼠； 卵巢； 顆粒細(xì)胞； 培養(yǎng)； 鑒定

　　中圖分類號(hào)：R730.45文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A　文章編號(hào)：1004－616X(2009)03－0234－04

 

　　【ABSTRACT】 BACKGROUND AND AIM: To obtain and identify cultured granulosa cells from the ovary of rats so as to establish a convenient and stable experimental model. MATERIALS AND METHODS: Female SD rats were subcutaneously treated with pregnant mare serum gonadotropin (PMSG). Forty-eight hours after dosing with PMSG, the animals were decapitated and the ovaries were aseptically removed. Granulosa cells were then released by mechanical method, trypsin digestion and low-speed centrifugation separation were used for granulosa cells isolation. Granulosa cells were diluted and incubated in fresh DMEM-Ham's F-12 medium (1∶1) containing 15％ of fetal bovine serum at 37 ℃ in water-saturated environment of 5％ CO2. Hematoxylin ＆ Eosin (HE) and immunohistochemical staining of FSHR were used for ovarian granulosa cell identification. Additionally, the growth curves of granulosa cells and hormone levels at different incubation times were evaluated as well. RESULTS: Over 95％ of the cultured cells were ovarian granulosa cells．The exponential phase of growth was between 48 and 96 hours of incubation. CONCLUSION: More than 95％ of highly purified granulosa cells could be obtained by mechanical method combined with trypsin digestion and low-speed centrifugation. Moreover, identifications of granulosa cells by HE and FSHR staining were quick and convenient approaches.

　　【KEY WORDS】 rat; ovary; granulosa cell; culture; identification 

　　顆粒細(xì)胞是卵巢的主要功能細(xì)胞，其增殖與分化直接影響著卵泡的生長(zhǎng)啟動(dòng)、發(fā)育、排卵、黃體形成以及甾體激素分泌等卵巢功能活動(dòng)[1－2]。環(huán)境中有毒有害物質(zhì)對(duì)人和哺乳動(dòng)物的生殖毒害和機(jī)制至今仍在探索中，進(jìn)行顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)是研究化學(xué)毒物生殖毒性的基礎(chǔ)，是探索卵巢內(nèi)分泌功能及調(diào)控機(jī)制的重要手段，而如何獲得高質(zhì)量的顆粒細(xì)胞是生殖毒理學(xué)研究深入的關(guān)鍵。

　　盡管國內(nèi)外有關(guān)哺乳動(dòng)物卵巢顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng)已有文獻(xiàn)報(bào)道[3－5]，但迄今為止，尚無明確標(biāo)準(zhǔn)、高效、穩(wěn)定的的培養(yǎng)方法，本研究旨在通過改進(jìn)和完善顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定方法，為進(jìn)一步開展顆粒細(xì)胞體外生殖毒理學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

 

　　1　材料與方法

　　1.1　主要試劑和儀器

　　DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國HyClone公司，無支原體胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司, 孕馬血清促性腺激素(PMSG)購自杭州動(dòng)物藥品廠，四甲基偶氮唑鹽(MTT)、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，DAB顯色試劑盒、卵泡刺激素受體(FSHR)兔多克隆抗體購自武漢博士德公司，伊紅、蘇木素購自北京中杉金橋生物工程有限公司。雌二醇(E2)、孕酮(P)放射免疫測(cè)定試劑盒購自北京原子高科股份有限公司。

　　主要儀器包括組織培養(yǎng)顯微鏡，光學(xué)顯微鏡(Olympus)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo)，離心機(jī)(湖南湘儀)，GC-911 γ放射免疫計(jì)數(shù)器(中佳光電儀器分公司)等。

　　1.2　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

　　21～25日齡(50～60 g)清潔級(jí)健康SD大鼠10只，雌性，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

　　1.3　卵巢顆粒細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng)

　　參照Lovekamp等[3]介紹的方法加以改進(jìn)，雌性SD大鼠，每只皮下注射PMSG 40 IU，48 h后頸椎脫臼法處死。碘伏、酒精消毒，在無菌條件下迅速剖取卵巢放入預(yù)冷的無菌PBS中，去除卵巢周圍組織及表面包膜，PBS清洗后置于預(yù)冷的DMEM/F12培養(yǎng)基中。在解剖顯微鏡下用25號(hào)針頭刺破卵泡，使顆粒細(xì)胞釋放入  DMEM/F12培養(yǎng)基，離心管內(nèi)吹打分散成單個(gè)懸浮細(xì)胞。加入0.25％胰蛋白酶－0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)1 ml，于37 ℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中消化60 min，期間從培養(yǎng)箱取出用吸管反復(fù)吹打懸液2～3次(以組織消化為黏液狀、顆粒細(xì)胞團(tuán)塊分離為準(zhǔn))，加入含有胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，200目不銹鋼細(xì)胞篩過濾。800 r/min離心5 min，洗滌濾液，棄上清收集細(xì)胞。向沉積在離心管底的疏松細(xì)胞團(tuán)中加入DMEM/F12培養(yǎng)基(含15％胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素) 制成單細(xì)胞懸液。臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)。將細(xì)胞稀釋成濃度為3.0×105/ml的細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中或培養(yǎng)板中，在37 ℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h后換液1次，去除未貼壁細(xì)胞；此后隔日換液1次。

　　1.4　顆粒細(xì)胞鑒定

　　1.4.1　HE染色　取生長(zhǎng)旺盛的第4 d的細(xì)胞，用0.25％胰蛋白酶－0.02％EDTA消化后制成1×105/ml的細(xì)胞懸液，種植于已預(yù)置好小蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，放人CO2 培養(yǎng)箱中，在37 ℃、5％ CO2及完全飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70％融合時(shí)取出玻片，用PBS沖洗蓋玻片3次，每次5 min。4％多聚甲醛固定20 min。取出細(xì)胞爬片，PBS沖洗2次，蘇木素染色2 min，流水沖去浮色，入鹽酸酒精中分色數(shù)秒，流水沖洗3 min，鏡下細(xì)胞核染色清晰，胞漿不著色。5％伊紅染色2～3 min，流水沖去浮色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片后光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

　　1.4.2　FSHR表達(dá)鑒定顆粒細(xì)胞　細(xì)胞爬片制作同前，4％多聚甲醛固定。按以下步驟進(jìn)行細(xì)胞免疫化學(xué)染色：固定好的細(xì)胞爬片，PBS洗滌3 min×3次；3％ H2O2室溫孵育5 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS清洗5 min×3次；加正常山羊血清封閉無關(guān)抗原，室溫下孵化20 min，傾去不洗。滴加一抗FSHR兔多克隆抗體(1∶200), 4 ℃過夜，PBS清洗 5 min×3次。滴加二抗IgG，37 ℃孵育 60 min；PBS清洗5 min×3次。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉素工作液50 μl， 37 ℃孵育 30 min；PBS清洗5 min×3次。DAB 顯色(顯微鏡下控制顯色時(shí)間)；自來水沖洗，蘇木素復(fù)染10 min；自來水沖洗3次；常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

　　1.5　細(xì)胞生長(zhǎng)特性觀察

　　將分離得到的細(xì)胞按每孔1×104個(gè)接種于96孔板，每孔200 μl。在培養(yǎng)過程中每24 h對(duì)試驗(yàn)組進(jìn)行1次檢測(cè)，每次檢測(cè)6個(gè)孔，直至接種培養(yǎng)后的第9 d，取各時(shí)間點(diǎn)平均值。檢測(cè)時(shí)，每孔添加180 μl 不含血清的培養(yǎng)液和20 μl MTT(5 mg/ml)，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩    10 min，自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定490 nm處的吸光度值(A)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

　　1.6　雌二醇(E2)和孕酮(P)含量

　　將生長(zhǎng)旺盛細(xì)胞接種到24孔培養(yǎng)板，用含15％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞密度為1.0×105/ml，每孔l ml，37 ℃、5％ CO2條件下培養(yǎng)   12 h、24 h后分別收集細(xì)胞培養(yǎng)液(在終止培養(yǎng)前3 h加入100 ng/ml FSH)，用放射免疫法測(cè)定雌二醇(E2)和孕酮(P)的含量，以評(píng)價(jià)細(xì)胞的功能狀態(tài)。

 

　　2　結(jié)　果

　　2.1　卵巢顆粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

　　臺(tái)盼藍(lán)染色表明，實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)細(xì)胞的存活率>90％，初始階段細(xì)胞形狀呈圓形或橢圓形，其中有部分小而圓的其他細(xì)胞(如紅細(xì)胞)。卵巢顆粒細(xì)胞呈單層貼壁性生長(zhǎng)，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞開始貼壁、增殖；培養(yǎng)48 h后細(xì)胞明顯增殖，貼壁良好，生長(zhǎng)旺盛(見圖1，2)。經(jīng)HE染色后，在鏡下可見貼壁細(xì)胞形態(tài)完整，邊緣清晰，大小均一，呈多角形或梭形，核染深藍(lán)色呈卵圓形或不規(guī)則形，胞漿淡紅色(見圖3)。卵巢顆粒細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

 

　　2.2　FSHR表達(dá)鑒定顆粒細(xì)胞

　　FSHR免疫細(xì)胞化學(xué)染色是卵巢內(nèi)顆粒細(xì)胞的特異性染色，F(xiàn)SHR陽性染色定位于細(xì)胞胞漿，呈棕褐色著染，細(xì)胞核呈深藍(lán)色，鏡下可見FSHR的陽性率>95％(見圖4)，由此表明分離培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞純度達(dá)到95％以上。

 

　　2.3　細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

　　細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見圖5。由圖可見，卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)初期隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增殖，培養(yǎng)24 h細(xì)胞處于貼壁生長(zhǎng)適應(yīng)期，A值增加不顯著，培養(yǎng)48 h后A值開始大幅度的增高，判斷細(xì)胞迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，到72 h細(xì)胞生長(zhǎng)極度旺盛，A值達(dá)到最大值；隨后進(jìn)入平臺(tái)期，第5 d開始逐漸下降，6 d開始顯著下降直至第  9 d結(jié)束吸光度測(cè)定。

　　2.4　雌二醇(E2)和孕酮(P)的分泌

　　12 h、24 h的卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液E2和P的分泌量見表1，培養(yǎng)液中E2和P的分泌量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)均升高，培養(yǎng)24 h后E2和P水平均值分別達(dá)到103.36 pg/ml和77.91 pg/ml。

 

　　3　討　論

　　隨著生殖毒理學(xué)研究的深入，環(huán)境化學(xué)毒物引起的各種女性生殖損害已引起了人們的高度重視，通過有效地研究環(huán)境有毒有害因子對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的影響及其調(diào)控機(jī)制，可深入了解毒物對(duì)卵巢毒性作用機(jī)理。目前，毒理學(xué)研究中對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的應(yīng)用越來越廣。如何簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定的分離和培養(yǎng)卵巢顆粒細(xì)胞是研究化學(xué)毒物生殖毒性的基礎(chǔ)和必要手段。

　　結(jié)合已有文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用21～25 d雌性SD大鼠進(jìn)行卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)，相比成年大鼠而言，新生大鼠顆粒細(xì)胞在離體前未接觸過內(nèi)源性促性腺激素的刺激，采用PMSG刺激雌性SD大鼠使之處于動(dòng)情前期，獲得大量相同發(fā)育階段的顆粒細(xì)胞。進(jìn)而采用機(jī)械分離方法使顆粒細(xì)胞釋放出來，既減少了對(duì)細(xì)胞的損傷，保持細(xì)胞形態(tài)完整，又使污染細(xì)胞減少。胰蛋白酶消化結(jié)合低速離心分離卵巢顆粒細(xì)胞可去除其他混入的細(xì)胞(如紅細(xì)胞)及組織碎片，提高顆粒細(xì)胞存活率和純度。體外培養(yǎng)24 h后顆粒細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng)，48～96 h內(nèi)細(xì)胞大量增殖，生長(zhǎng)旺盛，并可獲得較高的細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3－4]。

　　鑒于顆粒細(xì)胞是卵巢內(nèi)唯一可表達(dá)FSHR的細(xì)  胞[6－7]，筆者在通過HE染色觀察顆粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，特別采用細(xì)胞FSHR表達(dá)陽性作為鑒定顆粒細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，在培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞中，F(xiàn)SHR的陽性率可達(dá)到95％以上，獲得的高純度顆粒細(xì)胞可最大程度保存細(xì)胞的特性，將使系列生殖毒理有關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更加可信。卵泡顆粒細(xì)胞在維持雌性生殖功能上具有重要作用，顆粒細(xì)胞分泌雌激素為卵細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育提供了重要的微環(huán)境。實(shí)驗(yàn)期間，顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中E2和P分泌量隨著時(shí)間增加而升高，表明培養(yǎng)的細(xì)胞具備并可維持正常的生理功能。

　　綜上所述，純度高、活性好的原代培養(yǎng)顆粒細(xì)胞可為化學(xué)毒物毒性評(píng)價(jià)提供一個(gè)很好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)所建立的細(xì)胞培養(yǎng)體系是可行的、理想的，適合進(jìn)行相關(guān)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)。

 

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收稿日期： 2008－10－27； 修訂日期： 2008－12－24

基金項(xiàng)目： 國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(30630056)；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)項(xiàng)目(30800900)；重慶市重大科技專項(xiàng) (CSTC2006AA7003)

作者簡(jiǎn)介： 許川(1980－　)，男，湖北荊門人，主治醫(yī)師，博士研究生，研究方向：環(huán)境毒理學(xué)。E－mail:xuchuan100@163.com.

Correspondence to： SHU Wei-qun, E－mail: wqshu@mail.tmmu.com.cn