●  必須用極干燥的分析純NaBr。NaBr晶體使用前在210℃烘箱中過夜，取出后儲存在干燥器中

●  配置密度：1.006g /ml，9g/l

             1.016g /ml，27g/l

             1.063g /ml，95g/l

             1.210g /ml，283.4g/l

             1.368g /ml，524.8g/l

● 配置NaBr用溶劑0.05％EDTA（PH7.0），使用前EDTA必須過濾，儲存在褐色瓶中，4℃，使用前要析測密度（用阿貝折射儀或其他恒溫折射儀（濃度－密度配置表見后）

 

Ⅰ. 去除血細胞：1000xg，20分

Ⅱ. 去除乳糜粒（見技術(shù)講座文獻）

Ⅲ. 用血清/1.386g/m溶液=1:4的比例混合分離用樣品液

（例：P40ST水平轉(zhuǎn)頭用0.2ml血清加0.8ml 1.386g/ml，NaBr液；P35ZT區(qū)帶離心轉(zhuǎn)頭用200ml血清加800ml 1.386g/ml NaBr液）

Ⅳ. 梯度鋪設(shè)：如果用13ml離心管，則底部加1ml混合樣品液，然后依次向上分層鋪設(shè)：3.2ml，1.21g/ml NaBr；3.8ml 1.063g/ml NaBr液；3.3ml，1.016g/ml NaBr液；1.2ml 1.006g/ml NaBr液。

如果用P35ZT區(qū)帶轉(zhuǎn)頭則先從轉(zhuǎn)頭外測從低密度到高密度依次加入1.006，1.016，1.063，1.21梯度液最后加入樣品混合液，參考容量依次為74ml，193ml，228ml，195ml及1000ml。

 

● P40ST轉(zhuǎn)頭：38,500rpm（263,000xg），24hrs，14℃，加速“8”，減速“7”

● P35ZT區(qū)帶轉(zhuǎn)頭：35,000rpm（122,000xg），49hrs，14℃

 

● P40ST轉(zhuǎn)頭：離心后可以用手工收集也可以用日立DGF－U（密度梯度制備－收集儀），手工收集每管（13ml）收集或40管，分別測O.D.值（280mm及260mm）繪出O.D.－管數(shù)值曲線。根據(jù)各峰頂對應(yīng)位置可以找到各種密度脂蛋白所在管。

用DGF－U收集時將抽出管聯(lián)接到帶流動池的分光光度計，流動池連續(xù)測量O.D.，并在記錄儀上繪出O.D.－管數(shù)的連續(xù)曲線。再根據(jù)O.D.峰對應(yīng)位置找到各種密度脂蛋白所在管。

●  P35ZT轉(zhuǎn)頭：用Masterflex管道泵將40％w/w NaBr液體從轉(zhuǎn)頭外測連續(xù)泵入轉(zhuǎn)頭，中心管接到分光光度計流動池，從中心管排出的樣品連續(xù)測定O.D.，并在記錄儀上繪出O.D.－管數(shù)曲線，一般根據(jù)需要可以收集成50－100管，和P40ST同樣方法決定各種不同密度脂蛋白所在管。

 

5. 結(jié)果：用P40ST轉(zhuǎn)頭分離純化收集后各種密度脂蛋白分布如下：

用P35ZT分離的結(jié)果可根據(jù)峰位置決定管序數(shù)

 

6. 討論：可分別測A260與A280，根據(jù)A280/A260比值可估計蛋白質(zhì)純度，如果某個峰值A(chǔ)280/A260≈1.8，說明蛋白質(zhì)較純。