用葡聚糖（Dextran）和聚乙二醇（Polyethyleneglycol,PEG）二相不連續(xù)梯度分離純化動(dòng)植物樣品的細(xì)胞膜片斷（特別是質(zhì)膜）的方法始于1989年（文獻(xiàn)1）。這種方法的特點(diǎn)是快速，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好。只需要低速離心機(jī)（4,000rpm），分離成本低。

用PEG和Dextran 混合后再加入樣品，低速離心后形成上下二個(gè)液體相，體積相近。上液體相中對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞的亞細(xì)胞構(gòu)造的排列，順序是（自下而上），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)<線粒體<溶酶體<高爾基體<質(zhì)膜；對(duì)于植物細(xì)胞其排列順序（自下而上）是：破碎的類囊體<完整的葉綠體<糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)<線粒體，過氧化酶體<液泡膜<滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)<類囊體<高爾基體<溶酶體<質(zhì)膜。

 

常用的方法是：組織勻漿先以低速離心（甩平轉(zhuǎn)頭，500g，3min）去除沒有破碎的整細(xì)胞及其他組織碎片。上清液與Dextran 及PEG 混合后再低速離心（3,000xg，15min）形成二個(gè)液體相。

 

離心方案：

1. 原液制備：

   Dextran （20％w/w）：220克 Dextran T-500 (Pharmacia 產(chǎn)品) 溶于780克純水，電磁攪拌器加熱（40℃）并攪拌至全部溶解。

   PEG（3350，Union Carbide 公司出品，或相應(yīng)產(chǎn)品）300克溶于1升水。

2. 制備液體二相：取200克，20％ Dextran ，103克PEG原液，33ml 0.2M Na3PO4 (PH6.5)和179ml 純水在量筒中充分混合，靜置過夜形成二相液體，PEG在上，Dextran 在下。可以看到明顯的分界面，中間有較窄的隔離帶。分別取出二液態(tài)相備用（Dextran下相包含隔離帶）

3. 用合適的方法將含有107--108 個(gè)細(xì)胞的動(dòng)、植物組織制備成勻漿，用低速小型冷凍離心機(jī)水平轉(zhuǎn)頭（如Hitachi CF-RX 系列離心機(jī)，T5SS31 甩平轉(zhuǎn)頭或 CF-7D2 離心機(jī)T5SS 轉(zhuǎn)頭，最大容量 4×250ml 單管容量從5ml 到 250ml，用戶可按實(shí)際情況選用不同容量的離心管。也可以用其他品牌離心機(jī)和相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭）

4. 勻漿在500g （約1,600rpm）4℃離心3分鐘去除沒有裂解的細(xì)胞和組織（在沉淀中）

5. 第一次離心后的上清液在3,000xg （約4,100rpm）4℃ 離心15分鐘，保留沉淀。

6. 將第二次離心后的沉淀加入尚未形成二相的Dextran--PEG 混合液（第2步前段），充分混合。2,000xg（約3,300rpm）, 4℃離心10分鐘。離心后仍保持4℃。等待形成明顯的二個(gè)液態(tài)相（有隔離帶），亞細(xì)胞構(gòu)造分布于二個(gè)液態(tài)相之中。

7. 分別收集（6） 離心后形成的二個(gè)含有亞細(xì)胞構(gòu)造的液態(tài)相備用（上相和下相，下相包含隔離帶）

8. 根據(jù)容量選擇合適的離心管（常用50ml 帶蓋圓底管），第一類離心管下部是（2）中形成的Dextean液態(tài)相和隔離帶；上部是（7）中用水稀釋（3—5倍）的上相。上、下部體積比為6:4。

9. 第二類離心管下部是（7）中離心后的下相（包含隔離帶），上部是（2）中制備的PEG液態(tài)相，上、下部液體的比例為4:6

10. 以上二類離心管，分別用上下顛倒30—40次的方法充分混合后分別離心（3,000xg，約4,100rpm，4℃，10分鐘）

11. 第一類離心管離心后上部液態(tài)相中主要含質(zhì)膜片斷，下部為其他亞細(xì)胞構(gòu)造

12. 第二類離心管離心后上部及隔離帶中主要含質(zhì)膜片斷，下部為其他亞細(xì)胞構(gòu)造

 

討論：

1. 不同的組織，分離質(zhì)膜的離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間及PH值各有差異，可以從實(shí)驗(yàn)中摸索，優(yōu)化。

2. 離心后其他亞細(xì)胞構(gòu)造可以用文獻(xiàn)中介紹的其他方法進(jìn)一步分離純化（例如用Percoll，Nycodenz，metrizamide作自形成梯度分離）

 

參考文獻(xiàn)：

1. Fisher. D. and Sutherland, I.A.  “Separations using aqueous phase system”—Applicaion In cell biology and biotechnology . plenum press , New York .1989

2. W . Howard  Evans  “Isolation and characterization of membranes and cell organelles”, from “Centrifugation” Edited by David Rickwood，Oxford  Univ. press 1992

3. Presson  A. 等      Biochem . J .  vol:273  P173 (1991)

注：本文主要內(nèi)容摘自文獻(xiàn)（2）