Yu 2004.11.09

     血清脂蛋白是由血液中脂質(zhì)與某些特異的蛋白質(zhì)組成的一類不均一的復(fù)合物。因其所含脂與載脂蛋白的比例不同，其密度范圍在0.96g/ml(或更低)到1.21g/ml之間。紙電泳中顯示四條帶，即：乳密微粒，極低密度脂蛋白（VLDL,也稱前β脂蛋白），低密度脂蛋（LDL，也稱β脂蛋白），高密度脂蛋白（HDL，也稱α脂蛋白）。每種脂蛋白還可以分為更多的亞組分。

 

    用電泳法分離含載脂蛋白較高的組份（HDL，VHDL）比較成功，而離心分離法則適合用于各種密度的血清脂蛋白分離。

 

1梯度材料：

 

血清脂蛋白密度較低，常用的梯度材料為Nacl,NaI,Kbr,KI等，常用的緩沖劑為EDTA。

 

表一 常用梯度材料的配置及密度（20°C）

名稱	配置	密度（g/ml）
Nacl	0.196 mol/L	1.006
NaBr	0.804 mol/L	1.063
NaBr	2.705 mol/L	1.21
KBr	0.747 mol/L	1.063
KBr	1.496 mol/L	1.21
NaCl+KBr+EDTA	153gNaCl+354gKBr+10ml 0. 2mol/L EDTA+水至總量1000ml	1.35
NaCl,NaBr A液:200gNaCl+800ml水 B液:400gNaBr+600ml水 C液:11.14gNaCl+788.6ml水(ρ=1.006g/ml)	10ml A液+31.7mlB液 10ml A液+15.6mlB液 10ml C液+2ml 1.35液 4ml C液+6ml 1.35液	1.35   1.31     1.063     1.21

 

2預(yù)分離：

 

2.1血細(xì)胞與血清分離：

　　離心參數(shù)：全血，角轉(zhuǎn)頭，3000rpm×20min

　　結(jié)果：沉淀為血細(xì)胞，上部為血清。

 

2.2乳糜粒分離：禁食12小時以上人血漿中乳糜粒含量極少，已進(jìn)食者因其血漿含乳糜粒高，應(yīng)先離心去除乳糜粒。

　　離心參數(shù)：4 ×10⁶ (g×min),10°C，各種轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速均可。

　　梯度液配置：離心管下部3/4容積加血漿，上部1/4容積加0.15 mol/L NaCl+ 0.3 mol/L EDTA,pH7.4

　　結(jié)果：乳糜粒上浮，吸出。

 

2.3血清蛋白分離：除去球蛋白、白蛋白及其它蛋白質(zhì)。

　　離心參數(shù)：（2.5-3）×10⁶(g×hr), 各種轉(zhuǎn)頭均可。如角轉(zhuǎn)頭70000rpm× 6hrs,10℃

　　配置：管容量1/3為血清，2/3為1.31g/ml,NaCl+NaBr,攪拌后終密度為1.21g/ml

　　結(jié)果：管上部1/6容積為血清脂蛋白，下部5/6為其他蛋白。

 

3方法：

 

3.1順序浮選法：

　 3.1.1超速法：最早使用的方法，40000rpm×24hrs×3次，10℃

NaCl+NaBr梯度按1.006，1.063，1.21順序浮選，每次在管上部取出不同密度之脂蛋白。操作簡單，分辨率高，得率高，費(fèi)時，成本高。

　　3.1.2超高速法：100000rpm×2.5hrs×2次，10℃, 100000rpm×4hrs×1次，NaCl+KBr+EDTA梯度按不含密度浮選出VLDL，LDL，HDL

 

3.2單次離心法：

 

3.2.1單次甩平分離

 

用最高轉(zhuǎn)速為25000~28000 rpm,6×40ml甩平轉(zhuǎn)頭以1.006g/ml NaCl液及1.35g/ml(NaCl+KBr+EDTA)液配置成從 1.006至1.21的8層不連續(xù)階梯度，最下部用血清與KBr配成1.25g/ml樣品液，25000rpm×4hrs,4℃一次得到VLDL，LDL，HDL不同層區(qū)帶。

 

用最高轉(zhuǎn)速為40000 rpm, 6×13ml甩平轉(zhuǎn)頭，40000 rpm×24hrs，20℃，不連續(xù)KBr梯度1.006~1.21g/ml,細(xì)長管，分層清晰，回收率高，離心時間長

 

3.2.2單次垂直管分離：

 

NaCl/KBr或NaCl/NaBr不連續(xù)梯度單管容量從5ml到40ml，轉(zhuǎn)速從50000 rpm~80000 rpm，離心（0.5-3）hrs,下層用KBr或（NaBr）將血清調(diào)至1.3g/ml上層用1.006g/ml,NaCl液，10℃-20℃，增加，減速一次分出。

 

NaCl/蔗糖不連續(xù)梯度下層為48%W/W蔗糖,中層血清在4mol/L NaCl中，上層為0.67M NaCl+0.05% EDTA,離心參數(shù)同上，時間較長。

 

3.2.3區(qū)帶轉(zhuǎn)頭大容量分離：

 

離心參數(shù)：區(qū)帶轉(zhuǎn)頭，最高轉(zhuǎn)速30000~48000rpm, 容量從650ml~1900ml,每次可分離血清50-150ml,低速加樣及卸載，分離轉(zhuǎn)速：大轉(zhuǎn)頭（25000-28000rpm）×2hrs，小轉(zhuǎn)頭（30,000-38,000rpm）×1hrs，10℃-20℃

 

梯度液：(NaCl+NaBr或KBr)+EDTA不連續(xù)或線性梯度，樣品在最大密度層，近轉(zhuǎn)頭核心處用純水做隔離層，分離室最外部用高密度NaCl/KBr或NaCl/NaBr作緩沖層。

 

收集：泵出后依此經(jīng)帶流動地的紫外檢測儀檢測，自動部分收集器收集。

 

4討論：

 

1、用以上方法分離的VLDL，LDL，MDL，還可以進(jìn)一步用長離心管縮小不連續(xù)梯度密度差，分離出其亞組份。

 

2、實(shí)驗(yàn)質(zhì)量很大程度上取決于密度標(biāo)定，配置后可用密度劑或折射儀校核。

 

3、超分析超離心法可精確分離微量血清脂蛋白，并可測定各種組份（包括其亞組份）的上浮系數(shù)Sf。

 

作者：余興明   電話：13764301893,yuxingming@techcomp.cn