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                                                              English | 中文版 | 手機(jī)版 企業(yè)登錄 | 個(gè)人登錄 | 郵件訂閱
                                                              當(dāng)前位置 > 首頁 > 技術(shù)文章 > 亞細(xì)胞構(gòu)造的離心分離概論

                                                              亞細(xì)胞構(gòu)造的離心分離概論

                                                              瀏覽次數(shù):3689 發(fā)布日期:2005-3-10  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
                                                              現(xiàn)代生物學(xué)研究常常需要提取和純化細(xì)胞及組織中的亞細(xì)胞構(gòu)造(細(xì)胞核、質(zhì)膜、內(nèi)笪綱、高爾基體、線粒體、溶酶體、微粒體等等)。在經(jīng)過選擇的最合適的生物體勻漿制備后,用離心法提取和純化亞細(xì)胞構(gòu)造是最常用、也是最有效的實(shí)驗(yàn)手段。
                                                               
                                                              (一)勻漿制備:
                                                                將生物體組織剪切成2~3毫米小塊或小片,以每100毫升加濕重5~10克配置組織液,即可用下列各種勻漿設(shè)備制備勻漿。
                                                               �。╥)帖床式勻漿機(jī):
                                                                最常用,可調(diào)速,磨頭可手操作升降的實(shí)驗(yàn)室勻漿機(jī)。
                                                              常用聚四氟乙烯園柱型帶球形頂端的磨頭。定制的硬質(zhì)玻璃容器,磨頭在玻璃容器中既旋轉(zhuǎn)又上下移動(dòng)。磨頭與容器間隙可根據(jù)需要調(diào)整在0.05~0.15毫米之間。
                                                                制備某些大溫度敏感的材料,容器可固定在一個(gè)封閉園筒中,園筒通以冷卻水,避免勻漿制備過程中這樣品溫度升高。冷卻水可用自來水也可以用低溫循環(huán)水槽的外循環(huán)冷卻水。
                                                                這種勻漿機(jī)最常用于"軟"組織(腦、肝等)的勻漿制備,常用將速在1500轉(zhuǎn)/分以下,磨頭上下升降5~15次。
                                                                (ii)剪切型勻漿機(jī)。
                                                                轉(zhuǎn)頭分為硬度、可產(chǎn)生相對(duì)剪切運(yùn)動(dòng)的多刀刃刀片,轉(zhuǎn)速較高(10000轉(zhuǎn)/分)下,可調(diào)。適用于較"硬"組織(肌肉,心肌,內(nèi)臟等等)的勻漿制備。
                                                                (iii)高壓 氣體破碎法(主要是N2):20~100大氣壓,10~60分鐘也可以制備勻漿。
                                                                (iv)超聲波破碎機(jī):可產(chǎn)生很高的液體剪切力。但對(duì)生物大分子(DNA,RNA等)有破壞作用,常用于只研究亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的勻漿制備。
                                                               �。╲)大量樣品用的制備型工業(yè)勻漿泵:綜合利用機(jī)械剪切與細(xì)胞真空炸裂原理制造的高效勻漿(均質(zhì))設(shè)備用于生產(chǎn)型勻漿制備。
                                                               
                                                              (二)過濾:根據(jù)樣品的實(shí)際情況,在勻漿制備前或會(huì),為了濾去某些不得不 破碎的組織顆粒,可用優(yōu)質(zhì)棉布或尼龍布(單層或多層)過濾樣品。
                                                              (三)供參考的初步離心法:
                                                               
                                                               
                                                              (四)亞細(xì)胞構(gòu)造的進(jìn)一步純化:
                                                                (i)溶劑:為了避免質(zhì)膜及其他亞細(xì)胞器的損傷,保證在離心過程中組織不變性,常用的溶劑有1mM EDTA, 0.1~1mM PMSF, 5~10mM Tris或Hepes等等,具體配置請(qǐng)參閱有關(guān)文獻(xiàn)。
                                                                (ii)差分法:經(jīng)過多次繁復(fù)的差分離心分離也可以純化各種亞細(xì)胞器,但常常是事倍功率:很大的離心工作量,得到不太高的純度。由于離心技術(shù)的進(jìn)展,目前已少用,本文不作介紹。(如果有人感興趣,可與作者聯(lián)系)
                                                              (iii)密度梯度離心法:(略,詳見參考文獻(xiàn))
                                                              ① 各種亞細(xì)胞構(gòu)造的沉降系數(shù)范圍:
                                                              細(xì)胞核:5×106~8×106
                                                              質(zhì)膜(大片):105~6×105
                                                              質(zhì)膜(小片):5×101~5×103
                                                              內(nèi)質(zhì)綱片斷:101~103
                                                              溶酶體,線粒體:2×103~8×103
                                                              ②各種亞細(xì)胞器的尺寸及其在典型梯度材料中的浮密度:
                                                              名稱
                                                              尺寸
                                                              密度
                                                              (µ m)
                                                              蔗糖中
                                                              Ficoll
                                                              Percoll
                                                              Metrizamid
                                                              Nycodenz
                                                              3~12
                                                              >1.3
                                                              /
                                                              1.09
                                                              1.22
                                                              1.23
                                                              線粒體
                                                              0.5~2
                                                              1.19
                                                              1.14
                                                              1.10
                                                              1.16
                                                              1.17
                                                              溶酶體
                                                              0.5~0.8
                                                              1.21
                                                              /
                                                              1.06
                                                              1.13
                                                              1.15
                                                              質(zhì)膜(大片)小顆粒
                                                              3~20
                                                              1.16~1.18
                                                              ~1.05
                                                              ~1.03
                                                              1.14~1.26
                                                              1.11~1.19
                                                              0.05~3
                                                              1.13
                                                              內(nèi)質(zhì)網(wǎng)
                                                              0.05~0.3
                                                              1.06~1.23
                                                              /
                                                              /
                                                              /
                                                              /
                                                               
                                                               
                                                               
                                                               
                                                               
                                                               
                                                               
                                                               
                                                               
                                                               
                                                              ③推薦的離心參數(shù)
                                                              方法
                                                              名稱
                                                              差分沉降在0.25M蔗糖液中
                                                              速率—區(qū)帶密度梯度離心5~20g蔗糖液中5℃
                                                              等密度離心(ISOPYCNIC)(同左或其他合適介質(zhì)中)
                                                              1000g×10分鐘
                                                              500g×10分鐘
                                                              4000g×60分鐘
                                                              線粒體
                                                              10000g×20分鐘
                                                              5000g×10分鐘
                                                              80000g×100分鐘
                                                              溶酶體
                                                              10000g×20分鐘
                                                              5000g×10分鐘
                                                              80000g×100分鐘
                                                              內(nèi)質(zhì)網(wǎng)
                                                              150000g×40分鐘
                                                              10000g×20分鐘
                                                              100000g×200分鐘
                                                              微粒體
                                                              100000g×60分鐘
                                                              10000g×30分鐘
                                                              10000g×360分鐘
                                                              質(zhì)膜大片
                                                              10000g×15分鐘
                                                              ~100000g×100分鐘
                                                              ~150000g×600分鐘
                                                              (小顆粒)
                                                              100000g×60分鐘
                                                               
                                                               
                                                               
                                                               
                                                               
                                                               
                                                               
                                                               
                                                               
                                                               
                                                               
                                                               
                                                              作者:余興明   電話:13764301893,

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