原位分子雜交和免疫組化SP法對(duì)PTEN的檢測(cè)

 

【摘要]目的：
研究原位分子雜交和免疫組化sP法檢測(cè)PTEN mRNA及其蛋白在HCC中的表述隋況。
方法：56例肝細(xì)胞肝癌組織、17例肝硬化組織手術(shù)切除標(biāo)本，經(jīng)40g／L福爾馬林固定，4 m厚連續(xù)切片，HE染色，病理診斷證實(shí)。
結(jié)果：HCC組織中，PTENmRNA~蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為62.5％和71.4％。17例肝硬化

組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為88．2％和94．1％。21例癌旁組織中的陽(yáng)性率分別為90.5％和100％。HCC與肝硬化組織和癌旁肝組織中PTEN  mRNA及其蛋白的表達(dá)具有顯著性差異(P<005)。
結(jié)論:HCC組織中存在較高比例PTEN mRNA和蛋白表達(dá)缺失，且惡性程度最高的Hcc組織中，PTENmRNA和蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率最低。

 

 

PTEN(phosphatase and tensin homologuedeleted on chromosome ten)基因是1997年發(fā)現(xiàn)的一種新的腫瘤抑制基因。它在很多種腫瘤中存在著突變和缺失，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。PTEN具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶雙重活性，是目前為止發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有脂質(zhì)磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN的蛋白磷酸酶活性具有抑制細(xì)胞侵襲的作用；PTEN的脂質(zhì)磷酸酶活性具有抑制細(xì)胞周期進(jìn)展和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。肝細(xì)胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一叫。HCC的發(fā)生是一個(gè)十分復(fù)雜和多步驟的過(guò)程，其中可能有多種抑癌基因的改變。因此，對(duì)抑癌基因的深入探討，無(wú)論對(duì)HCC發(fā)病機(jī)理的闡明，還是對(duì)HCC的預(yù)防和治疤都具有重要的意義。

2007-2008年56例肝細(xì)胞肝癌組織、17例肝硬化組織均為湖南省腫瘤醫(yī)院病理科手術(shù)切除標(biāo)本，經(jīng)40g／L福爾馬林固定，4“m厚連續(xù)切片，HE染色，病理診斷證實(shí)。HCc的分級(jí)按照WHO的標(biāo)準(zhǔn)分為高分化(I級(jí))7例，中分化(II級(jí))28例，低分化(II級(jí))21例。21例帶有癌旁肝組織，其中肝硬化11例，慢性活動(dòng)性肝炎5例，慢性遷延性肝炎5例。原位雜交：1)切片常規(guī)脫蠟至水，3％H O封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫作用10min；2)蒸餾水洗3X5min。3)3％檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶，37~C消化30min，充分暴露mRNA核酸片段。4)0．5M，pH7．4的PBS緩沖液振洗3×5arin。5)滴加阻斷液，40C作用2h，以阻止非特異性的雜交。傾去，勿洗。6)滴加預(yù)雜交液，40~C作用2h。傾去，勿洗。7)滴加雜交液，42E雜交過(guò)夜。8)30～37℃水溫的2×SSC緩沖液振洗2×15min。9)滴加封閉液，37E30min。傾去，勿洗。lO)滴加抗地高辛抗體堿性磷酸酶復(fù)合物，37℃60min。11)o．5M，pH7．4的PBS緩沖液振洗4x5min。12)~o顯色液顯色，1％鹽酸酒精分化，順序酒精、二甲苯脫水透明，中性樹(shù)膠封片，以正常肝組織做陽(yáng)性對(duì)照，預(yù)雜交液代替雜交液做陰性對(duì)照。免疫組織化學(xué)SP法：1)切片常規(guī)脫蠟至水，30mL·L甲醇一HO液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫作用30arin。2)水沖洗，0．01M，pH7．4的PBS緩沖液浸泡10min。3)微波抗原修復(fù)：切片置于盛有0．01M，pH6．0的檸檬酸鹽緩沖液的臥式缸中，上覆有通氣孔的塑料薄膜，在高檔加熱1-2min，待修復(fù)液沸騰后，調(diào)至低檔繼續(xù)加熱8min。置于室溫，使切片自然冷卻。4)0．01M，pH7．4的PBS緩沖液振洗3×5rain。5)正常羊血清室溫封閉30min。傾去，勿洗。6)滴加1：100的兔抗PTEN多克隆抗體，4℃過(guò)夜。7)0．01M，pH7．4的PBS緩沖液振洗3x5min。8)滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃作用標(biāo)記的鏈酶卵白素，37℃作用30min。11)o．01M，pH7．4的PBS緩沖液振洗3x5min。12)DAB顯色，蘇木素復(fù)染，l％鹽酸酒精分化，順序酒精、二甲苯脫水透明，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察。以正常肝組織

做陽(yáng)性對(duì)照，0．01M，pH7．4的PBS代替一抗做陰性對(duì)照。結(jié)果判定及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：凡胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯的淡藍(lán)色顆粒(原位分子雜交)、棕黃色顆粒(免疫組織化為PTEN陽(yáng)性細(xì)胞。在肝組織中，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞與全部細(xì)胞的比例分為：陰性：無(wú)陽(yáng)性瘤細(xì)胞，陽(yáng)性(+)：陽(yáng)性細(xì)胞／J、于25％陽(yáng)性(++)：陽(yáng)性細(xì)胞占25％～5O％l陽(yáng)性(+++)：陽(yáng)性細(xì)胞大于5&／o。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用Sf 10．O統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩樣本構(gòu)成比采用檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著陛差~gNP<O．05。

2．1原位雜交PTEN
mRNA定位于胞質(zhì)，陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈淡藍(lán)色顆粒，PTEN mRNA陽(yáng)性細(xì)胞呈彌漫性分布。3例正常肝組織中PTEN mRNA的表達(dá)均為陽(yáng)性；17例肝硬化組織中，PTENmRNA表達(dá)陽(yáng)性率為88．2％(15／17)，見(jiàn)圖1；21例癌旁肝組織中，PTEN mRNA陽(yáng)性表達(dá)3,g~j90．5％(19／21)，見(jiàn)圖2；而56例HCC組織中PTEN mRNA表達(dá)的陽(yáng)性率為62．5％(35／56)，見(jiàn)圖3。PTENmRNA在癌旁肝組織及肝硬化組織中的表達(dá)明顯高于HCC組織(P<0．05，表1)。56例HCC組織中，I和II級(jí)PTEN mRNA表達(dá)明顯高于Ⅲ級(jí)(P<O．05，表2)，而在I與II級(jí)之間，則無(wú)明顯差異。

2．2免疫組織化學(xué)結(jié)果
PTEN蛋白主要定位于胞質(zhì)，陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕色或棕黃色顆粒，彌漫性分布。3例正常肝組織中PTEN蛋白的表達(dá)均為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)；肝硬化組織中PTEN蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為94．1％(16／17)，主要為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；21例癌旁肝組織均為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)：而56例HCC組織中PTEN蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率為71．4％(40／56)(表3)，免疫反應(yīng)強(qiáng)弱不等，一些標(biāo)本中，陽(yáng)性信號(hào)較弱。癌旁組織與肝硬化組織中，PTEN的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于HCC組織(P<0．O1)。在6例HCC組織中，I、II級(jí)PTEN蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于III級(jí)(尸<0．05，表4)，而在I與II級(jí)之間，則無(wú)明顯差異。另#hi、II級(jí)PTEN蛋白的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度明顯高于III級(jí)，多為++～+++，而III級(jí)組織中，PTEN染色多為弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)。

本研究應(yīng)用原位雜交技術(shù)和免疫組織化學(xué)技術(shù)，對(duì)56例HeC組織和17例肝硬化組織及3例正常的肝組織進(jìn)行了PTENmRNA和PTEN蛋白的檢測(cè)。在所有3例正常肝組織中，PTEN mRNA和PTEN蛋白均呈陽(yáng)性表達(dá)。在17例肝硬化組織中，PTEN mRNA和PTEN蛋白表達(dá)均呈不同強(qiáng)度的陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率分別為88．2％(15／17)和94．1％(16／l7)。56例HCC組織中，PTEN mRNA和PTEN蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為62．5％和71．4‰而2l例癌旁組織中，PTEN mRNA和PTEN蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為90．5％(19／21)30min。9)0．01M，pH7．4的PBS緩沖液振洗3X5arin。10)滴加辣根酶和100％。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，PTEN mRNA和PTEN蛋白在癌旁和肝硬化組織中的表達(dá)與其在HCC組織中的表達(dá)具有顯著性差異(P<0．05)。這表明，PTENmRNA和PTEN蛋白在HCC的發(fā)生發(fā)展中存在著缺失，提示其有可能在HCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到一定的作用。到目前為止，關(guān)于PTEN基因在HCC組織和細(xì)胞中的研究也只是局限于對(duì)基因突變和缺失的研究，對(duì)于PTENmRNA及其蛋白在肝癌組織中的表達(dá)情況，卻很少有報(bào)道。本文的研究結(jié)果表明，PTEN在mRNA和蛋白水平的表達(dá)缺失在惡性程度高的HCC組織中存在著相當(dāng)高的比例，有可能~_PTEN基因在HCC中失活的主要方式之一。因此，深刻闡明PTEN基因在人體正常組織中的作用及其作用機(jī)制，對(duì)明確肝細(xì)胞肝癌的發(fā)病機(jī)制，采取相應(yīng)有效的基因治療方法具有重大的意義。

PTEN mRNA及其蛋白都主要定位于胞質(zhì)中。它們?cè)诎┡越M織和肝硬化組織中的表達(dá)都明顯高于HCC組織<0．o5)。HCC組織中PTENmRNA及其蛋白的表達(dá)與HHCC的分化程度呈正相關(guān)。HCC的分化程度越高，PTEN mRNA及其蛋白的表達(dá)率越高。提示，PTEN基因在肝癌的發(fā)生發(fā)展中可能起到一定的作用。

（當(dāng)代醫(yī)學(xué) 王勁）