microRNAs（miRNA）是一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA，一般具有18到25個核苷酸，其序列在進化上高度保守，通過靶向特定mRNA來調(diào)節(jié)基因的表達。

miRNA是越來越受關注的轉錄后調(diào)控網(wǎng)絡（post-transcriptional control）中重要的調(diào)控因子。首先，miRNA結合到核糖核蛋白（Ribonucleoprotein，RNP）復合物中，形成RNA誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex, RISC），然后通過不完全的堿基互補靶向到目標mRNA的3’UTR區(qū)，再通過引導酶切影響了mRNA的穩(wěn)定性，或直接阻礙翻譯過程，從而介導特異mRNA靶標的轉錄后基因沉默。

miRNA參與轉錄后調(diào)控網(wǎng)絡。miRNA靶向到目標mRNA的3’UTR區(qū)，抑制靶mRNA的蛋白表達。（摘自Chatterjee & Pal, Biol Cell. 2009）

miRNA對許多生理過程產(chǎn)生重要影響，如細胞生長、凋亡、應激應答、干細胞分化潛能的維持以及新陳代謝等。據(jù)估計，脊椎動物基因組編碼多達1000種不同的miRNA，研究人員推測，這些miRNA可能調(diào)控至少30%的基因的表達。盡管研究人員目前已在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)超過530種miRNA，但仍需進一步研究以了解這些分子的確切的細胞學功能，及其在疾病發(fā)生中所扮演的角色。

對miRNA的研究表明，miRNA表達量的上調(diào)或是下降都可能與致癌基因或是抑癌基因的調(diào)節(jié)有關，因此miRNA在癌癥生成中起重要的作用。通常而言，與發(fā)生分化了的細胞類型有關的miRNA在腫瘤細胞中的表達減少，而那些在早期發(fā)育及干細胞中便有所表達的miRNA卻保留下來。

一些在腫瘤中過度表達的miRNA通過下調(diào)抑癌因子而促進腫瘤發(fā)生，如：
--在肝細胞癌中高表達的miR-21，靶向抑癌基因PTEN ；
--在淋巴瘤中高表達的miR-17-miR-92簇，靶向抑癌基因E2F1；
--在睪丸生殖細胞腫瘤中高表達的miR-372和miR-373，靶向抑癌基因LATS2。（摘自：Lujambio,AEsteller,M Cell Cycle 2009）

同時，一些在腫瘤中表達缺失的miRNA起著抑制癌癥的功能，如：
--在肺癌中中低表達的lethal-7（let-7）miRNA家族，靶向致癌基因KRAS、NRAS、MYC和high mobility group A2 (HMGA2)；
--在睪丸癌和套細胞淋巴瘤中低表達的miR-15a-miR-16-1簇，靶向致癌基因cyclin D1。

值得注意的是，這些miRNA的作用是組織和腫瘤特異性的，例如miR-155在白血病和淋巴癌中是高度表達的，并起著原癌基因的作用，而miR-155在內(nèi)分泌腫瘤中表達極大地下調(diào)，很可能對內(nèi)分泌腫瘤具有抑制作用。

最新的研究發(fā)現(xiàn)，許多miRNA參與晚期癌癥的特征--癌細胞擴散過程的調(diào)控，這些miRNA通過同時作用多條信號通路并靶向不同目標蛋白基因而對癌細胞擴散起激活或抑制的功能（詳見下圖）。

腫瘤轉移中miRNA調(diào)控的信號通路。在癌癥惡化過程中，通常表達上升的miRNA以紅色方框表示，而表達下降的miRNA以灰色方框表示。有助于上皮細胞-間充質轉化的蛋白編碼基因以綠色方框表示。EMT：epithelial-mesenchymal transition，上皮細胞-間充質轉化； ECM： extracellular matrix，胞外基質。（摘自Nicoloso etc., Nature Rev. Cancer 2009）

由于miRNA被發(fā)現(xiàn)在癌癥機理中起重要的作用，尤其是與腫瘤轉移相關聯(lián)，因此對于miRNA的研究來說，最讓人興奮的是有希望應有于癌癥治療中的RNA 抑制療法或模擬miRNA表達療法，尤其是對于出現(xiàn)腫瘤轉移的癌癥病人的治療。

但是miRNA具有成百上千個靶標，所以要完全理解一個miRNA和靶標的特異性反應與腫瘤發(fā)生之間的聯(lián)系，是一項非常具有挑戰(zhàn)性的工作，尤其是在癌癥研究中鑒別出miRNA的準確靶點仍然是一大難題�，F(xiàn)已知道m(xù)iRNA的調(diào)節(jié)功能是通過結合不同的蛋白質或RNA來實現(xiàn)的，因此研究miRNA與蛋白的結合情況對于揭示miRNA的功能及指導RNA療法的研發(fā)具有重要意義。Robert Nakamura博士是Advanced Genetic Systems公司的首席執(zhí)行官，作為驗證RNA-蛋白復合物作為治療靶點有效性的專家，他認為“我們知道RNA結合蛋白在不同的生理狀態(tài)下會結合不同的RNA。通過從細胞中分離完整的RNA-蛋白復合物，我們可以確認分子間的特異性相互作用，從而有希望為治療疾病找到破壞這些相互作用的方法�！�

RIP技術（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA結合蛋白免疫沉淀），是研究細胞內(nèi)RNA與蛋白結合情況的技術，是了解轉錄后調(diào)控網(wǎng)絡動態(tài)過程的有力工具，能幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點。RIP這種新興的技術運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來，然后經(jīng)過分離純化就可以對結合在復合物上的RNA進行分析。RIP可以看成是普遍使用的染色質免疫沉淀ChIP技術的類似應用，但由于研究對象是RNA-蛋白復合物而不是DNA-蛋白復合物，RIP實驗的優(yōu)化條件與ChIP實驗不太相同（如復合物不需要固定，RIP反應體系中的試劑和抗體絕對不能含有RNA酶，抗體需經(jīng)RIP實驗驗證等等）。RIP技術下游結合microarray技術被稱為RIP-Chip，幫助我們更高通量地了解癌癥以及其它疾病整體水平的RNA變化。

Millipore基于磁珠的RIP實驗流程:




RIP 實驗基本原理：

• 用抗體或表位標記物捕獲細胞核內(nèi)或細胞質中內(nèi)源性的RNA結合蛋白

• 防止非特異性的RNA的結合

• 免疫沉淀把RNA結合蛋白及其結合的RNA一起分離出來

• 結合的RNA序列通過microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或 高通量測序（RIP-Seq）方法來鑒定

延伸閱讀：   95%的人類基因組并不編碼基因，而是產(chǎn)生大量的非編碼RNA，真正編碼蛋白質的基因只占人類總基因組的約2%。這些非編碼RNA在生命的生長發(fā)育的各個階段都發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，與艾滋病、白血病、糖尿病、畸形等多種病變密切相關，并且參與著干細胞和表觀遺傳學調(diào)控。而RNA-蛋白復合物驅動了幾乎所有細胞過程的基因表達的轉錄后調(diào)控，包括剪接（splicing）、出核轉運（nuclear export）、mRNA 穩(wěn)定性以及蛋白轉譯過程，因此，對基因調(diào)控的了解就有賴于確定這些過程中RNA的結合的變化。因此，RNA研究也被越來越多的科學家重視起來，目前已經(jīng)成為生命科學研究中一個炙手可熱的領域，而RIP技術也逐漸成為RNA研究領域的一項常規(guī)方法，幫助我們了解越來越受關注的轉錄后調(diào)控網(wǎng)絡。