張 亮¹ 閻瑾琦¹馬繼堯² 王 浩¹ 劉 寧¹ 賈銳¹ 韓 剛² 董金凱² 田仁禮² 于繼云[1]

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850； 2.解放軍總醫(yī)院 泌尿外科，北京 100853

 

[摘要]
目的：建立基因槍子彈制備以及轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)cos-7細(xì)胞系的方法，觀察基因槍介導(dǎo)真核表達(dá)質(zhì)粒pVax-Dsred-IRES-EGFP在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。
方法：亞精氨、氯化鈣沉淀法制備子彈，利用原子力顯微鏡觀察子彈制備（DNA+金顆粒）情況；以基因槍的方法分別轉(zhuǎn)染對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組cos-7細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞中紅、綠熒光蛋白的表達(dá)。
結(jié)果：成功制備基因槍子彈，DNA緊密包裹在金顆粒周圍�；�因槍介導(dǎo)的pVax-Dsred-IRES-EGFP成功轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)的cos-7細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)可檢測(cè)到紅、綠熒光的表達(dá)，而對(duì)照組則沒(méi)有檢測(cè)到熒光蛋白的表達(dá)。
結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)證明國(guó)產(chǎn)新芝SJ-500型基因槍能夠有效介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)移，基因槍轉(zhuǎn)染的cos-7細(xì)胞能夠有效表達(dá)報(bào)告基因，本研究為小鼠腫瘤模型的免疫治療奠定了基礎(chǔ),為基因槍介導(dǎo)的DNA疫苗經(jīng)皮免疫提供了可靠實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]
基因槍；細(xì)胞轉(zhuǎn)染；真核表達(dá)載體；熒光蛋白；cos-7

 

基因治療對(duì)于多種疾病，尤其是對(duì)惡性腫瘤、遺傳性疾病、傳染性疾病的治療具有巨大的應(yīng)用前景^[1,2]。問(wèn)題的關(guān)鍵在于如何建立一個(gè)安全、高效的基因?qū)�入系統(tǒng)，為此，人們?cè)囼?yàn)和嘗試發(fā)展了數(shù)十種病毒型和非病毒型載體運(yùn)用于臨床研究。然而，2000年美國(guó)賓州大學(xué)以重組病毒為載體的基因治療藥物臨床試驗(yàn)造成了受試者死亡^[3]，后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)病毒型載體有可能改變被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的主要功能和局部環(huán)境^[4],從而引發(fā)了人們對(duì)病毒型載體安全性的憂慮。因此,以非病毒為載體的基因轉(zhuǎn)移研究顯得越發(fā)重要，其中基因槍法因其具有其他方法所不具有的高效和便捷的特點(diǎn), 日益受到科研工作者的矚目^[5]。本研究室近期引進(jìn)了國(guó)產(chǎn)新芝SJ-500型手提式基因槍，用于腫瘤免疫基因治療的實(shí)驗(yàn)研究。為了驗(yàn)證該設(shè)備導(dǎo)入外源基因的有效性，遂進(jìn)行本研究。在使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)利用基因槍轉(zhuǎn)染基因方便、安全、有效，具有很好的臨床應(yīng)用前景。

1.1　材料

重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVax-Dsred-IRES-EGFP為本室構(gòu)建，為含有紅、綠熒光蛋白報(bào)告基因的雙順?lè)醋诱婧吮磉_(dá)載體質(zhì)粒，可以在轉(zhuǎn)染的真核核細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)紅、綠熒光蛋白；cos-7細(xì)胞為本室保存；DMEM培養(yǎng)基為Gibco BRL公司產(chǎn)品；新生牛血清購(gòu)自杭州四季青責(zé)任有限公司；新芝SJ-500型手提式基因槍、吹氮干燥儀購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司；金粉購(gòu)自AlFa Aesar；氦氣、無(wú)水乙醇均為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院科研條件處供應(yīng)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

將傳代培養(yǎng)的cos-7細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前一天分至60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，使其在轉(zhuǎn)染當(dāng)天生長(zhǎng)密度達(dá)到80%-90%。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組每組各3塊培養(yǎng)板，對(duì)照組的子彈不加入質(zhì)粒DNA，實(shí)驗(yàn)組子彈每發(fā)含有1.5μgDNA。子彈制備過(guò)程同1.2.2。

1.2.2 基因槍子彈制備

精確稱取60mg金粉，加入1ml無(wú)水乙醇，超聲波粉碎機(jī)超聲3-5分鐘，待手感發(fā)燙時(shí)12000rpm離心去除上清。在沉淀中加入1ml無(wú)水乙醇,混勻，12000rpm離心去除上清，重復(fù)上述過(guò)程二次，離心后在沉淀的金粉中加入1ml無(wú)水乙醇重懸,4℃冰箱保存。

制備子彈時(shí)，取400μl上述混合液離心，去除上清后加0.1M亞精氨160μl，輕輕混勻，然后加入1.5μg/μlpVax-Dsred-IRES-EGFP質(zhì)粒50ul（空白組加入等量的去離子水），渦旋輕混時(shí)，逐滴加入2.5M氯化鈣400μl，混勻后室溫沉淀10分鐘，待上清液變清亮離心15秒，去除上清，加入1ml無(wú)水乙醇重懸沉淀，12000rpm離心5秒，去上清，重復(fù)上述過(guò)程二次。加入3ml無(wú)水乙醇重懸沉淀。將金顆粒-質(zhì)粒DNA乙醇溶液吸入Tefzel管中,使金顆粒沉淀在管的內(nèi)表面上,吸去乙醇,用氦氣將管吹干,將管切成約1.5cm的小段即制成子彈。

1.2.3 基因槍介導(dǎo)的pVax-Dsred-IRES-EGFP轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的cos-7細(xì)胞系

轉(zhuǎn)染時(shí)，將培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)也液倒掉，將基因槍連接至氦氣鋼瓶，將壓力調(diào)為1000kpa，轟擊距離設(shè)定為2cm，轟擊培養(yǎng)的cos-7細(xì)胞系一槍。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各轟擊3塊培養(yǎng)皿，轉(zhuǎn)染pVax-DsRed-IRES-EGFP后,將細(xì)胞置入37℃,5%CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。轟擊后24小時(shí),取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞系在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況。