目前市場上有四種高通量測序儀，分別是Solexa，454 (GS-FLX)，SOLiD和Polonator。根據(jù)測序原理，它們可以被分為兩大類：使用合成法測序(Sequencing by Synthesis)的Solexa和454，及使用連接法測序(Sequencing by Ligation)的Polonator和SOLiD。這些高通量測序儀的共同點是不需要大腸桿菌系統(tǒng)進行DNA模板擴增，且測序所得序列較短：其中的454序列最長，為200～300個堿基，其余三種序列都只有幾十個堿基。測序原理及序列長度的差異決定了各種高通量測序儀具有不同的應(yīng)用領(lǐng)域。這就要求我們在熟悉各種高通量測序儀內(nèi)在技術(shù)特點的基礎(chǔ)上進行選擇。

      基因組所引進的SOLiD (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection)是ABI（Applied Biosystems）公司生產(chǎn)的高通量測序儀。目前這臺SOLiD運行穩(wěn)定，SOLiD實驗及數(shù)據(jù)分析小組也可以為大家提供專業(yè)的技術(shù)服務(wù)。所以接下來的關(guān)鍵是如何把SOLiD測序儀應(yīng)用到符合其技術(shù)特點的科研項目中。本短文將簡單介紹SOLiD測序流程，雙堿基編碼原理及數(shù)據(jù)分析原理，以幫助大家了解SOLiD測序儀的技術(shù)特點和應(yīng)用范圍。

1.SOLiD關(guān)鍵技術(shù)及其原理
      SOLiD使用連接法測序獲得基于“雙堿基編碼原理”的SOLiD顏色編碼序列，隨后的數(shù)據(jù)分析比較原始顏色序列與轉(zhuǎn)換成顏色編碼的reference序列，把SOLiD顏色序列定位到reference上，同時校正測序錯誤，并可結(jié)合原始顏色序列的質(zhì)量信息發(fā)現(xiàn)潛在SNP位點。
1.1. SOLiD文庫構(gòu)建
      使用SOLiD測序時，可根據(jù)實際需要，制備片段文庫(fragment library)或末端配對文庫(mate-paired library)。簡單地說，制備片段文庫就是在短DNA片段（60～110 bp）兩端加上SOLiD接頭（P1、P2 adapter）。而制備末端配對文庫，先通過DNA環(huán)化、Ecop15I酶切等步驟截取長DNA片段（600bp到10kb）兩末端各25 bp進行連接，然后在該連接產(chǎn)物兩端加上SOLiD接頭。兩種文庫的最終產(chǎn)物都是兩端分別帶有P1、P2 adapter的DNA雙鏈，插入片段及測序接頭總長為120～180 bp。
1.2:油包水PCR
      我們知道，文庫制備得到大量末端帶P1、P2 adapter但內(nèi)部插入序列不同的DNA雙鏈模板。和普通PCR一樣，油包水PCR也是在水溶液進行反應(yīng)，該水相含PCR所需試劑，DNA模板及可分別與P1、P2 adapter結(jié)合的P1、P2 PCR引物。但與普通PCR不同的是，P1引物固定在P1磁珠球形表面 (SOLiD將這種表面固定著大量P1引物的磁珠稱為P1磁珠)。PCR反應(yīng)過程中磁珠表面的P1引物可以和變性模板的P1 adapter負鏈結(jié)合，引導模板合成，這樣一來，P1引物引導合成的DNA鏈也就被固定到P1磁珠表面了。
      油包水PCR最大的特點是可以形成數(shù)目龐大的獨立反應(yīng)空間以進行DNA擴增。其關(guān)鍵技術(shù)是“注水到油”，基本過程是在PCR反應(yīng)前，將包含PCR所有反應(yīng)成分的水溶液注入到高速旋轉(zhuǎn)的礦物油表面，水溶液瞬間形成無數(shù)個被礦物油包裹的小水滴。這些小水滴就構(gòu)成了獨立的PCR反應(yīng)空間。理想狀態(tài)下，每個小水滴只含一個DNA模板和一個P1磁珠，由于水相中的P2引物和磁珠表面的P1引物所介導的PCR反應(yīng)，這個DNA模板的拷貝數(shù)量呈指數(shù)級增加，PCR反應(yīng)結(jié)束后，P1磁珠表面就固定有拷貝數(shù)目巨大的同來源DNA模板擴增產(chǎn)物。ABI公司提供的SOLiD實驗手冊已經(jīng)把小水滴體積及水相中DNA模板和磁珠的個數(shù)比等重要參數(shù)進行了技術(shù)優(yōu)化和流程固定，盡可能提高“優(yōu)質(zhì)小水滴”(水滴中只含一個DNA模板一個P1磁珠)的數(shù)量，為后續(xù)SOLiD測序提供只含有一種DNA模板擴增產(chǎn)物的高質(zhì)量P1磁珠。
1.3．含DNA模板P1磁珠的固定
      SOLiD測序反應(yīng)在SOLiD玻片表面進行。含有DNA模板的P1磁珠共價結(jié)合在SOLiD玻片表面。磁珠是SOLiD測序的最小單元。每個磁珠SOLiD測序后形成一條序列(具體SOLiD測序過程請見圖5)。
1.4. SOLiD雙堿基編碼原理及測序流程
      SOLiD“雙堿基編碼原理”實質(zhì)上是闡明了熒光探針的顏色類型與探針編碼區(qū)堿基對的對應(yīng)關(guān)系。SOLiD連接反應(yīng)的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物。連接反應(yīng)中，這些探針按照堿基互補規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對。如圖1“底物探針”所示，探針5’末端可分別標記“CY5，Texas Red，CY3，6-FAMTM”4種顏色的熒光染料，并且這四種顏色用數(shù)字“3，2，1，0”示意；探針3’端1～5位為隨機堿基，可以是“A，T，C，G”四種堿基中的任何一種堿基，其中第1、2位構(gòu)成的堿基對是表征探針染料類型的編碼區(qū)，“雙堿基編碼矩陣”規(guī)定了該編碼區(qū)16種堿基對和4種探針顏色的對應(yīng)關(guān)系，而3～5位的“n”表示隨機堿基，6～8位的“z”指的是可以和任何堿基配對的特殊堿基，由上可知，SOLiD連接反應(yīng)底物中共有45 種底物探針。
      單向SOLiD測序包括五輪測序反應(yīng)。每輪測序反應(yīng)含有多次連接反應(yīng)（一般情況下，片段文庫是7次，mate-paired文庫是5次，所以片段文庫共有35個連接反應(yīng)，而末端配對文庫共有25次連接反應(yīng)）。每輪測序反應(yīng)的第一次連接反應(yīng)由與P1引物區(qū)域互補的“連接引物”介導。這五種連接引物長度相同，但在P1引物區(qū)域的位置相差一個堿基(分別用n，n-1，n-2，n-3，n-4表示)，都含有5’端磷酸，所以可以介導連接反應(yīng)的進行�，F(xiàn)以圖5所示一個磁珠上發(fā)生的SOLiD測序反應(yīng)為例進行說明。第一輪測序的第一次連接反應(yīng)由連接引物“n”介導，由于每個磁珠只含有均質(zhì)單鏈DNA模板(也就是每個磁珠表面的單鏈DNA模板序列都是一樣的)，所以這次連接反應(yīng)摻入一種8堿基熒光探針，SOLiD測序儀記錄反應(yīng)模板序列第1、2位堿基序列的探針第1、2位編碼區(qū)顏色信息，隨后的化學處理斷裂探針3’端第5、6位堿基間的化學鍵，并除去6~8位堿基及5’末端熒光基團，暴露探針第5位堿基5’磷酸，為下一次連接反應(yīng)作準備。由此我們知道第一次連接反應(yīng)使合成鏈多了5個堿基，所以第二次連接反應(yīng)得到反應(yīng)模板序列第6、7位堿基序列的顏色信息，而第三次連接反應(yīng)得到的是第11、12位堿基序列的顏色信息… … 以此類推，第一輪測序反應(yīng)獲取了模板鏈7個堿基對的顏色信息。如圖5所示，由于第二輪連接引物n-1比第一輪錯開一位，所以第二輪得到是以0，1位起始的7個堿基對的顏色信息。五輪測序反應(yīng)反應(yīng)后，按照第0、1位，第1、2位... …的順序把對應(yīng)于模板序列的顏色信息連起來，就得到由“0，1，2，3”組成的SOLiD原始顏色序列。
1.5. 數(shù)據(jù)分析原理
      SOLiD測序完成后，獲得了由顏色編碼組成的SOLiD原始序列（圖6.a）。理論上來說，按照“雙堿基編碼矩陣”（圖4），只要知道所測DNA序列中任何一個位置的堿基類型，就可以將SOLiD原始顏色序列“解碼”成堿基序列。但由于雙堿基編碼規(guī)則中雙堿基與顏色信息的兼并特性（一種顏色對應(yīng)4種堿基對），前面堿基的顏色編碼直接影響緊跟其后堿基的解碼，所以一個錯誤顏色編碼就會引起“連鎖解碼錯誤”，改變錯誤顏色編碼之后的所有堿基(圖6.1)。
      和所有其它測序儀一樣，測序錯誤在所難免，關(guān)鍵是對測序錯誤的評價和后續(xù)處理。為避免“連鎖解碼錯誤”的發(fā)生，SOLiD數(shù)據(jù)分析軟件不直接將SOLiD原始顏色序列解碼成堿基序列，而是依靠reference序列進行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。SOLiD序列分析軟件首先根據(jù)“雙堿基編碼矩陣”把reference堿基序列轉(zhuǎn)換成顏色編碼序列，然后與SOLiD原始顏色序列進行比較，來獲得SOLiD原始顏色序列在reference的位置，及兩者的匹配性信息。Reference轉(zhuǎn)換而成的顏色編碼序列和SOLiD原始序列的不完全匹配主要有兩種情況：“單顏色不匹配”和“兩連續(xù)顏色不匹配”(圖6)。由于每個堿基都被獨立地檢測兩次(圖5)，且SNP位點將改變連續(xù)的兩個顏色編碼(圖6.2)，所以一般情況下SOLiD將單顏色不匹配處理成測序錯誤，這樣一來，SOLiD分析軟件就完成了該測序錯誤的自動校正；而連續(xù)兩顏色不匹配也可能是連續(xù)的兩次測序錯誤，SOLiD分析軟件將綜合考慮該位置顏色序列的一致性及質(zhì)量值來判斷該位點是否為SNP。
2.SOLiD測序技術(shù)的應(yīng)用
2.1. 基因組測序
      全基因組重測序。研究者可以基因組DNA為初始樣本構(gòu)建SOLiD文庫(fragment文庫及mate-paired文庫)，以恰當?shù)娜�基因組序列為reference，可以快速鑒定SNP，indel及基因組結(jié)構(gòu)變化。
      特定基因組區(qū)域測序。除應(yīng)用于傳統(tǒng)的ChIP-seq，SOLiD技術(shù)平臺還可以結(jié)合芯片技術(shù)，富集特定基因組序列進行深度測序，快速鑒定SNP。其關(guān)鍵技術(shù)流程如下：SOLiD fragment文庫經(jīng)適當循環(huán)數(shù)PCR擴增得到足量樣品DNA(約30ug), 文庫擴增產(chǎn)物與Agilent芯片(或其它自訂制芯片)雜交，然后對芯片探針緊密結(jié)合的洗脫產(chǎn)物進行常規(guī)Emulsion PCR及SOLiD測序。SOLiD結(jié)合芯片技術(shù)對基因組特定區(qū)域的進行深度測序，可發(fā)現(xiàn)低頻率SNP（如腫瘤樣本中特定基因的體細胞突變）。
2.2. RNA-seq
      高通量測序儀的問世，使得測序成本大大降低，提供了不依賴現(xiàn)有基因模型的大規(guī)�；�因表達譜研究手段，促進了針對細胞全部轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(small RNA 等non-coding RNA，低拷貝protein-coding RNA及其可變剪接體）的深度挖掘及后續(xù)功能研究。
      目前有兩種SOLiD試劑盒促進SOLiD測序儀在轉(zhuǎn)錄組上的應(yīng)用。SOLiD small RNA 試劑盒以含5’段磷酸及3’段羥基的small RNA為初始樣本，2天就可完成與SOLiD RNA特異adapter連接，逆轉(zhuǎn)錄，PCR擴增等步驟, 得到SOLiD fragment 文庫。SOLiD whole transcriptome expression試劑盒針對序列較長的non-coding RNA或mRNA。該試劑盒使用RNA H將mRNA或去除rRNA的總RNA片段化并回收酶切產(chǎn)物，其后實驗流程和SOLiD small RNA完全相同。這兩種試劑盒以RNA為初始樣本，并且所用的RNA 特異adapter方向確定，所以最后測序所得序列的方向也就確定了。而傳統(tǒng)方法大多以雙鏈cDNA為初始樣本，難以確定測序所得序列來自轉(zhuǎn)錄本的正義鏈還是反義鏈而干擾后續(xù)數(shù)據(jù)分析。同時，SOLiD強大的測序能力，使得高通量發(fā)掘低拷貝轉(zhuǎn)錄本成為可能。
3. 基因組所SOLiD測序儀運行情況
      目前，ABI公司針對我所SOLiD實驗小組的技術(shù)培訓基本結(jié)束。SOLiD實驗小組已經(jīng)具備獨立構(gòu)建基因組片段文庫和末端配對文庫的能力，所構(gòu)建文庫各項質(zhì)量指標基本符合要求。作為ABI高級客戶，我們獲得了SOLiD small RNA 和SOLiD whole transcriptome expression試劑盒各一個。相關(guān)轉(zhuǎn)錄組學實驗正在進行中。
4.小結(jié)
      現(xiàn)在看來，SOLiD技術(shù)可對具有reference基因組序列的物種進行重測序，鑒定SNP，indel及基因組結(jié)構(gòu)變化；對含有全基因組序列且轉(zhuǎn)錄本注釋較好的物種開展轉(zhuǎn)錄組學研究，解析細胞轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的數(shù)量變化及其結(jié)構(gòu)信息。但SOLiD測序所得序列的長度只有幾十個堿基，數(shù)據(jù)分析過程依賴reference序列，目前尚沒有基于SOLiD原始顏色序列的從頭拼接(de novo assembly)軟件，這些不足之處大大限制了SOLiD技術(shù)在新物種測序領(lǐng)域的應(yīng)用。SOLiD測序儀內(nèi)在技術(shù)特點決定其并不適合每個測序項目。我們要根據(jù)課題實際情況(物種基因組研究現(xiàn)狀和測序通量要求等)理性判斷。
參考資料主要來源
      http://marketing.appliedbiosystems.com/mk/get/SOLID_KNOWLEDGE_LANDIN