高分辨率熔解曲線方法檢測不同的DNA雜合體

文章來源：Clinical Chemistry 51, No. 7, 2005

Distinguishing Different DNA Heterozygotes by High-Resolution Melting, Robert Graham,1 Michael Liew,2 Cindy Meadows,2 Elaine Lyon,2 and Carl T. Wittwer1,2* (1 Department of Pathology, University of Utah School of Medicine, Salt Lake City, UT; 2 Institute for Clinical and Experimental Pathology, ARUP, Salt Lake City UT; * address correspondence to this author at: Department of Pathology, University of Utah School of Medicine, Salt Lake City, UT 84132; fax 801-581-4517, e-mail carl.wittwer@ path.utah.edu)

最近，高分辨率熔解曲線法（High-resolution melting）作為一種可以在小的擴增子中來檢測單核苷酸多態(tài)性基因型的技術(shù)被引進。這種基于封閉小管子的方法（包括快循環(huán)的PCR）可以在15分鐘內(nèi)完成，并且不需要采用熒光定量PCR儀、等位基因特異性PCR和熒光標(biāo)記的寡聚核苷酸。該過程通過采用可以檢測異源雙鏈DNA的染料得以實現(xiàn)，這種染料在飽和的程度下也不會抑制PCR反應(yīng)。野生型和純合子的樣品可以通過熔解溫度( Tm)的遷移來區(qū)別。雜合子樣品和純合子樣品可以通過被改變的曲線形狀來更好的區(qū)分，而不是通過熔解溫度。雜合子樣品可以產(chǎn)生溶解溫度較同源雙鏈更低的異源雙鏈。雜合子產(chǎn)生的被放大的熔解曲線包括2個同源雙鏈和2個異源雙鏈，會產(chǎn)生一個傾斜的復(fù)合的熔解曲線。這種熔解曲線在形狀上可以很容易與純合子的曲線加以區(qū)別。

然而，在一個擴增子中不同的雜合子是否可以通過不同曲線的形狀被區(qū)分出來還不太清楚。根據(jù)擴增后產(chǎn)生的同源和異源雙鏈的情況，可以將SNPs分為四種類別。不同類別的SNPs異源雙鏈的錯配是不同的，因此，如果儀器的分辨率足夠有效的話，它們的熔解曲線是可以被區(qū)別的。并且，在同種類別中，不同的雜合子也是可以被區(qū)別出來。盡管這種錯配是相同的，但是最相近的參數(shù)穩(wěn)定性卻依賴于相鄰堿基的錯配，因此，預(yù)測出來的穩(wěn)定性常常是不同的。

我們從ARUP實驗室中選取用來做標(biāo)準(zhǔn)臨床基因型鑒定的HFE, V Leiden因子和II型多態(tài)因子的DNA樣品，采用MagNa Pure instrument (Roche)的方法來抽提DNA，采用基于LightCycler的鄰近雜交探針[adjacent hybridization probe(HybProbeTM)]的方法來確定基因型。采用探針融合分析基因型的一個優(yōu)點就是可以用探針鑒定出除了預(yù)期改變的序列以為的改變。在ARUP實驗室中進行常規(guī)的臨床分析時，一旦在意外的溫度下出現(xiàn)了異常的熔解峰時，樣品就會通過進一步的測序來確定序列的改變。在預(yù)計的突變附近的一些雜合的序列突變就可以被這樣鑒定出來。三個II型雜合子因子（all SNPs），四個V 雜合子 (2 SNPs, 1 個單堿基的缺失和 1 個復(fù)合的雜合子)和 6 HFE雜合子 (4 SNPs and 2復(fù)合雜合子)可被用來做比較。在選擇和完全鑒定樣品之后，通過ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc.)來確定DNA的濃度。如果可以的話，每個雜合子基因型的3個樣品可以被處理。

除非有必要重新設(shè)計引物來檢測所有的序列突變，前面描述的引物可以直接去用。SNPWizard 可以(http://DNAWizards.path.utah.edu)被用來設(shè)計引物。引物通過Integrated DNA Technologies來合成，并且用的時候不需要進一步的純化。除了將1X LCGreen ® PLUS (Idaho Technology)換成 LCGreen I外，PCR仍采用以前的程序來擴增。LCGreen PLUS比LCGreen I顏色更加鮮艷，并且可以被用在具有更寬廣變化的熔解測定儀上。擴增時的擴增子的序列，引物區(qū)域和特定的PCR條件被列在數(shù)據(jù)附錄的表1中。數(shù)據(jù)附錄是和在線版本的技術(shù)簡要說明（http://www.clinchem.org/content/vol51/issue7/）相匹配的。

PCR結(jié)束以后，毛細(xì)管在LightCycler中以20 °C/s的速度被加熱到90 °C，然后以20 °C/s的速度冷卻到40 °C以便更好的形成異源二聚體。將樣品從LightCycler中取出，然后在高分辨率的熔解曲線儀(HR-1; Idaho Technology)上進行分析。每個毛細(xì)管在59 °C時被插到儀器中，溫度以0.3 °C/s的速度上升，從65 到95 °C時encesrozygotese的溶，因此，預(yù)測的獲取熒光，此過程只需要1至2分鐘。通過熔解前的快速降溫，熔解過程中的快速加熱以及低濃度的Mg離子濃度均有助于檢測小的擴增子中異源二聚體。通過普通化的用戶軟件來分析熔解曲線，不同溫度遷移的曲線以不同的圖片形式被列出來。不同的圖片顯示出每個樣品和“標(biāo)準(zhǔn)”（通常是多種野生型曲線的一個平均值）樣品之間的區(qū)別，并且不應(yīng)該與衍生圖 (-dF/dT)相混淆，這種衍生圖 (-dF/dT)常常被用來分析低分辨率的熔解數(shù)據(jù)。因為曲線形狀和熔解溫度的微小差別就會變得異常明顯，因此，作為一種方便的方法，不同的圖可從整體上觀察高分辨率的熔解數(shù)據(jù)。

可以通過前面描述過的最近熱力學(xué)模型（nearest-neighbor thermodynamic models）的計算來預(yù)測出的兩個Tm值。該模型通過安裝Melting Wizard (http://DNAWizards.path.utah.edu)而獲得。沒有必要去修正因dUTP 代替dTTP的滲入而造成的影響。為了最大程度的增加Tm的區(qū)別，擴增子的長度最好比較短，盡管在產(chǎn)物中要想證明SNP的類型常需要超過500 bp的長度。對于不同的SNP( 在線數(shù)據(jù)附錄中的表格2)，計算出的Tm的差異在純合的野生型和純合的突 變型的擴增子中變化范圍在0.0°C到1.3 °C之間。對于單個的SNP來說，與最穩(wěn)定的同源雙聚體相比，異源雙聚體的不穩(wěn)定性常在1.1°C到3.0 °C之間變化，而與最不穩(wěn)定的同源雙聚體相比，異源雙聚體的不穩(wěn)定性在0.7°C到2.2 °C之間變化。對于復(fù)合雜合子來說，各自的不穩(wěn)定性在2.8–4.0 °C 和2.0–3.5 °C之間。

高分辨熔解技術(shù)對于區(qū)分相同擴增子內(nèi)的不同的雜合體是必要的。與高分辨率的HR-1分析方法相比，LightCycler產(chǎn)生的熔解曲線并不能保證分離出雜合子。如圖1所示，根據(jù)各自的4 對Tm值, 每個雜合子描繪出一條獨特的熔解曲線。這些獨特的熔解曲線的形狀通過標(biāo)準(zhǔn)化的溫度移位數(shù)據(jù)，以不同的圖形形式表現(xiàn)出來。在圖1A中，II因子和2個稀有雜合子（所有的家族１中的ＳＮＰｓ）可以清晰地從野生型中分離出來，并且也可以將它們彼此分離出來。在圖２Ｂ中，Ｖ Leiden因子和3個稀有的雜合子（一個ＳＮＰ，一個１-bp的缺失和一個復(fù)合雜合子）同樣有獨特的曲線。如預(yù)期所示，單個的SNPs和１-bp的缺失(單個未配對的基因座位)。在圖１Ｃ中，所有被檢測的雜合子，包括標(biāo)記的ＨＦＥ突變，３稀有的ＳＮＰｓ以及２個稀有的復(fù)合雜合子都可以被清晰得彼此分離出來，并且也能與野生型分離出來。在所有這些被研究的案例中，不同的雜合子都可以被區(qū)別出來，包括那些在同一個ＳＮＰ家族中的雜合子。

在Ｖ因子和HFE的等位基因上，因為２個而不是１個不穩(wěn)定的位置，因此復(fù)合雜合子可以很容易得與“單個”雜合子區(qū)別出來。非常有趣的是，純合的雙聚體與雜合的雙聚體根據(jù)其序列突變的順式和反式的不同，預(yù)測的Tm值也是不同的（在線數(shù)據(jù)補充中的表２）。這表明，熔解分析方法有可能使單倍體，至少是發(fā)生突變的單倍體處于相同的熔解結(jié)構(gòu)域中。

根據(jù)其分析方法的不同，目標(biāo)SNP附近的存在的意外地多態(tài)性有可能影響到基因型的鑒定。如果多態(tài)性發(fā)生在引物下面并且導(dǎo)致不期望的基因座位特異的PCR，所有基于PCR的方法都能進行適當(dāng)?shù)母淖�。�?/SPAN>同樣的問題也適用于被用來測序或者進行延伸反應(yīng)的內(nèi)部引物。除此之外，一些基于PCR的方法，包括測序在內(nèi)，都會識別和區(qū)分那些由于限制性片段長度多態(tài)性檢測方法和基于溫探頭檢測方法未能檢測到的多態(tài)性。用于用來挑選一系列溫度的（熔解檢測法）雜交探針方法常�？梢园l(fā)現(xiàn)預(yù)料之外的多態(tài)性的存在，但是可能需要通過進一步的研究來鑒定它們。在我們的研究中，小擴增子高分辨率的熔解方法可以區(qū)別所有被研究的雜合子。這包括２１個配對的比較，表明在小的擴增子中最隨機被選取的雜合子都可以被區(qū)分出來。

熔解分析法用來區(qū)分多序列突變的能力還存在著爭議。當(dāng)野生型的探針被用在標(biāo)準(zhǔn)的低分辨率的系統(tǒng)中時，19%到52%的可能存在SNP的雜合子有可能被與預(yù)期的雜合子突變體相混淆。盡管在這些儀器上已經(jīng)有了關(guān)于更好的溫度分辨率的報道，但是，很明顯，在探針下的稀有序列的突變有可能不能從普通標(biāo)記的突變中被區(qū)分出來。類似的關(guān)于擴增子熔化溫度確定基因型已經(jīng)被描述過了，并且著重講述了Ｔｍ區(qū)分變種的限制�！�

高分辨率熔解分析方法引入了熔解曲線形狀和Ｔｍ來區(qū)別不同的突變子。因為復(fù)合的雜合子熔解曲線包括2個同源雙鏈和2個異源雙鏈，Tm的含義并不明確，并且作為一種指標(biāo)，沒有熔解曲線的形狀那么有意義。復(fù)合熔解曲線的Tm是一半的雙鏈已經(jīng)熔化的溫度（傳統(tǒng)定義）還是衍生圖譜的峰值（普通推導(dǎo)）呢？

這兩種并不是一致的，因為異源雙鏈的作用，這樣的曲線在低溫度下是傾斜的。在這兩種情況下，Tm只是熔解曲線上的一個點，采用這種完全的熔解曲線，方便的以不同的模塊來顯示，可以用來區(qū)分絕大多數(shù)的雜合子（在本研究中的21中的21對隨機的配對比較）。

高分辨率的熔解分析方法分析方便，因為不需要處理步驟和分離步驟。在這種情況下，當(dāng)目標(biāo)片段的復(fù)雜性超過了擴增子基因型的熔解能力時，可以加入未被標(biāo)記的寡核苷酸探針。除了確定基因型以外，高分辨率的熔解分析方法還可以作為一種精確的掃描突變的工具被用在中鏈酰基輔酶A脫氫酶，C-kit和SLC22A5基因以及HLA的配型上。這種方法的特異性和靈敏性比變性的HPLC更強。并且不需要在比如溫度梯度，變性梯度或者是構(gòu)想靈敏膠中進行電泳分析。