培養(yǎng)基選用常見(jiàn)問(wèn)題
瀏覽次數(shù):4930 發(fā)布日期:2008-12-10
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一、如何選用培養(yǎng)基?
選擇培養(yǎng)基沒(méi)有一定標(biāo)準(zhǔn),有幾點(diǎn)建議可供參考:
- 建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基?梢圆殚單墨I(xiàn),或在購(gòu)買(mǎi)細(xì)胞株時(shí)咨詢。
- 本單位慣用的培養(yǎng)基不妨一試,許多培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞。
- 根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來(lái)選擇培養(yǎng)基。如小鼠細(xì)胞株多選1640;進(jìn)行細(xì)胞雜交、基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn),可選擇IMDM。
- 用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞,觀察其生長(zhǎng)狀態(tài),可以用生長(zhǎng)曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基,這是最客觀的方法,但比較繁瑣。
二、選擇便宜的培養(yǎng)基品種成本就低嗎?
- 通常,培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞,細(xì)胞也可以在不同培養(yǎng)液中生長(zhǎng);例如在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞,很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(zhǎng)。
- 培養(yǎng)基養(yǎng)份不同會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)效果不同,病毒或蛋白表達(dá)不同,應(yīng)該選擇效果最好的培養(yǎng)基,考慮生物制品的綜合成本;
- 最終目的是追求生物制品的得率——得率高則成本低。
三、L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎?它在溶液中不穩(wěn)定嗎?
L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的,脫掉氨基后, L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源,參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。 但L-谷氨酰胺在溶液中不穩(wěn)定,在高溫下會(huì)分解成吡咯烷酮和羧酸,也有一些毒降解產(chǎn)物如NH4+會(huì)不可逆轉(zhuǎn)地?fù)p壞細(xì)胞壁。
L-谷氨酰胺在不同溫度、不同pH值條件下的穩(wěn)定性研究如下。
四、為什么培養(yǎng)基中可以省去酚紅?
酚紅在培養(yǎng)基中被用來(lái)作為pH值的指示劑,研究表明,酚紅可以模擬固醇類(lèi)激素的作用(特別是雌激素),為避免固醇類(lèi)反應(yīng),用無(wú)酚紅培養(yǎng)基。
五、在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后,有效期是多長(zhǎng)?
一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí),您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_(kāi)始降解。
六、為什么不要用碳酸氫鈉調(diào)pH值?
如圖所示,培養(yǎng)基pH值隨著碳酸氫鈉量的增加,呈拋物線增長(zhǎng),當(dāng)碳酸氫鈉加到一定量時(shí),pH變化越來(lái)越小。而培養(yǎng)基的滲透壓值隨著碳酸氫鈉量的增加,呈直線增長(zhǎng),碳酸氫鈉量越大,滲透壓值越大。
如果為了達(dá)到工作pH值僅加入少量的碳酸氫鈉,而忽略滲透壓,一來(lái)可能會(huì)達(dá)不到緩沖效果而引起細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中pH值變化較劇烈,二來(lái)會(huì)使培養(yǎng)基成為低滲溶液,在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)易造成細(xì)胞膨脹破裂;如果為了達(dá)到工作pH值而加入大量碳酸氫鈉,一來(lái)可能會(huì)難以達(dá)到期望的pH值,二來(lái)會(huì)使培養(yǎng)基成為高滲溶液,在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)易造成細(xì)胞萎縮。
生產(chǎn)中最好通過(guò)實(shí)驗(yàn)找到合適滲透壓和pH值情況下的碳酸氫鈉加入量。下面是DMEM(HED)和MEM培養(yǎng)基的碳酸氫鈉與pH值、滲透壓的曲線。
DMEM(HED)培養(yǎng)基
MEM培養(yǎng)基
七、細(xì)胞生長(zhǎng)質(zhì)量很好,為什么病毒、蛋白表達(dá)量沒(méi)有提高?
細(xì)胞生長(zhǎng)質(zhì)量高是高表達(dá)的必要條件。
采用細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗是體外培養(yǎng)一定量的動(dòng)物細(xì)胞并接種病毒,利用病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖,得到預(yù)期的病毒抗原,然后制成疫苗。細(xì)胞生長(zhǎng)質(zhì)量包括細(xì)胞密度和形態(tài),沒(méi)有好的細(xì)胞生長(zhǎng)質(zhì)量就不可能有高的表達(dá)量。
但要注意的是,細(xì)胞生長(zhǎng)質(zhì)量好、密度厚度大時(shí)候病毒接種量也應(yīng)該相應(yīng)增大,表達(dá)量才會(huì)提高,否則前期的高質(zhì)量細(xì)胞培養(yǎng)就可能浪費(fèi)了。
同時(shí)病毒、蛋白的表達(dá)、分泌在一定濃度下可能會(huì)飽和,因此如欲獲得高表達(dá),還須研究合適的收液時(shí)間和次數(shù)。
八、污染是培養(yǎng)基質(zhì)量不好引起的嗎?
- 培養(yǎng)基不是無(wú)菌產(chǎn)品,但有菌落數(shù)量控制。
- 培養(yǎng)基在使用前通過(guò)高壓或過(guò)濾滅菌。
- 防止污染應(yīng)該注意以下事項(xiàng):
A.從污染的源頭開(kāi)始
- 確認(rèn)工作細(xì)胞庫(kù)是否被污染:用細(xì)菌、真菌及支原體無(wú)菌試驗(yàn)來(lái)確認(rèn)并排除。同時(shí)要對(duì)無(wú)菌試驗(yàn)培養(yǎng)基的靈敏度進(jìn)行驗(yàn)證。
- 確認(rèn)毒種工作種子批是否被污染:用細(xì)菌、真菌及支原體無(wú)菌試驗(yàn)來(lái)確認(rèn)并排除。同時(shí)要對(duì)無(wú)菌試驗(yàn)培養(yǎng)基的靈敏度進(jìn)行驗(yàn)證。
- 確認(rèn)所用培養(yǎng)基及其添加成分(如小牛血清、NaHCO3等)是否被污染:用細(xì)菌、真菌及支原體無(wú)菌試驗(yàn)來(lái)確認(rèn)并排除。同時(shí)要對(duì)無(wú)菌試驗(yàn)培養(yǎng)基的靈敏度進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)際生產(chǎn)中,可以從配制好的培養(yǎng)液中取少量加入營(yíng)養(yǎng)瓊脂于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),48小時(shí)即可觀察有無(wú)污染。
一些單位在使用血清時(shí)候往往不經(jīng)過(guò)過(guò)濾除菌處理便直接加入到培養(yǎng)液中,可能帶來(lái)污染。
- 其它:高壓滅菌設(shè)備、過(guò)濾除菌設(shè)備均應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證,確保滅菌和除菌效果;前者應(yīng)在投產(chǎn)前及其后的每6個(gè)月進(jìn)行驗(yàn)證,后者應(yīng)在每次除菌前、后進(jìn)行驗(yàn)證工作(至少應(yīng)在除菌后進(jìn)行一次)。
- 另外,應(yīng)將有毒區(qū)與無(wú)毒區(qū)嚴(yán)格分開(kāi),并有各自獨(dú)立的空氣凈化系統(tǒng)及孵室,有毒區(qū)對(duì)無(wú)毒區(qū)應(yīng)保持相對(duì)負(fù)壓,防止病毒對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞(尤其是細(xì)胞庫(kù))的污染。
B. 從GMP管理、SOP操作方面加強(qiáng)管理力度
- 每二周(或每周)對(duì)無(wú)菌操作室及潔凈區(qū)域按GMP要求進(jìn)行檢測(cè)
- 人員的GMP管理和無(wú)菌操作強(qiáng)化培訓(xùn)
C. 一些特殊情況
- 細(xì)菌的大小從0.1-700μm,為防止細(xì)小細(xì)菌的污染,過(guò)濾除菌應(yīng)盡量采用0.1μm的濾膜或?yàn)V芯。
- 大面積污染時(shí),應(yīng)對(duì)所有設(shè)施、用具及操作環(huán)境進(jìn)行徹底消毒。