基因芯片是指固定有許多有序列的寡核苷酸探針的載體,通過雜交檢測,對各種基因進行分析[ 1 ]
。由于它所具有的高通量性、快捷、便宜等優(yōu)點,在各個領(lǐng)域起著越來越重要的作用,其中也包括分子流行病學領(lǐng)域�；�因芯片主要用于菌株的地理流行病學分析、菌株的重要分子特征相關(guān)的流行病學分析———分子流行病學的病因?qū)W研究及傳染病的診斷與鑒別診斷。本文主要從芯片的原理、應(yīng)用及所存在問題等幾方面,初步探討基因芯片在傳染病流行病學應(yīng)用中的廣闊前景。

一、基本原理
Fodor 等[ 2 ]于1991
年首先提出了基因芯片的概念,進而隨著分子生物學的突飛猛進,尤其是人類基因組計劃的完成及后基因組研究工作的開展,基因芯片技術(shù)日趨成熟。它是一種通過微加工技術(shù)將成千上萬個寡聚核苷酸或cDNA 固定在一個很小的芯片上,用以對各種基因進行檢測和分析。目前,基因芯片的種類主要包括寡核苷酸芯片、cDNA 芯片、肽芯片和芯片實驗室(lab on a chip) 。芯片技術(shù)由于其高通量分析特征,對于分子生物學、分子流行病學及其他相關(guān)學科的研究將產(chǎn)生難以估量的影響。

基因芯片的基本原理是通過原位雜交方法,用已知的 DNA 序列檢測未知序列。目前,基因芯片主要用于DNA 突變分析[ 3 ] 、基因譜差異分析[ 428 ] 、基因診斷分析[ 9211 ]和大規(guī)模基因類型分析[ 12 ] 。其研制技術(shù)主要包括以下幾大步驟:寡核苷酸探針的合成、固定、雜交和檢測。 制造基因芯片的載體材料必須是固體片狀或薄膜,其表面硅烷化后可通過連接物將各種生物分子固定,應(yīng)用最普遍的是玻璃片。

目前,連接物通常是在醇化、氨化、二硫化或丙烯酰胺化處理的載體表面與探針連接[ 13218 ] 。寡核苷酸探針主要是通過獲取mRNA、逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA 探針獲得。逆轉(zhuǎn)錄過程中加入同位素或熒光素修飾的dNTP 標記;然后將合成后DNA 固定法固定在玻片上;再用標記的樣品與芯片上固定的探針間進行的特異性選擇反應(yīng),即雜交反應(yīng);最后,通過熒光顯微鏡檢測各雜交點的熒光信號強弱或不同熒光素的顏色(雙色熒光素標記) ,也可用同位素標記、化學發(fā)光檢測、電化學發(fā)光檢測及質(zhì)譜法等進行檢測。目前,基因芯片主要用于未知 DNA 片段檢測和基因譜差異分析。

國內(nèi)外有許多網(wǎng)站對基因芯片的概念、制造、種類等方面有非常詳細的報道[ 19222 ] ,本文不再贅述。

二、基因芯片在病原微生物及分子流行病學中的應(yīng)用
目前,基因芯片在真核生物方面的應(yīng)用較多,而在原核生物方面應(yīng)用剛剛起步,但基因芯片在分子流行病學中的應(yīng)
用已顯示出廣闊的前景,主要應(yīng)用于以下這些領(lǐng)域。

1. 菌株的地理流行病學分析:由于受方法學的限制,傳統(tǒng)的病原地理流行病學分析一次只能對病原體的少數(shù)基因進行分析,在實際分析中不可避免地會導致一些重要的數(shù)據(jù)的遺漏,這有可能使實驗結(jié)論與實際結(jié)果出現(xiàn)偏差,而芯片技術(shù)從根本上解決了這個問題。目前,應(yīng)用的實例很多,最有代表性的例子是有關(guān)對卡介苗(BCG) 的分析,卡介苗是計劃免疫中非常重要的一種菌苗。由于卡介苗的原始出發(fā)菌株在一次世界大戰(zhàn)中丟失,同時各國的卡介苗菌株通過多次傳代,部分基因已發(fā)生改變或缺失,因此,各國的卡介苗菌株可能存在很大的不同,這就給全球范圍內(nèi)的計劃免疫工作帶來了很大的不便。Behr 等[ 23 ] 用DNA 芯片檢測了多個國家卡介苗的子代菌株。他們通過人型結(jié)核桿菌H37Rv 的基因框架來分析卡介苗。用H37Rv 的全部3 924個開放閱讀框 (ORF) 中的3 902個ORF 制成芯片,對不同的卡介苗進行雜交。通過比較,發(fā)現(xiàn)了卡介苗菌株16 個缺失區(qū)域,長度從 1 903到12 733 bp 不等,其中4 個區(qū)域已有報道。他們將這些缺失區(qū)域進行統(tǒng)一命名,從RD1 到RD16。其中9 個區(qū)域卡介苗及牛型結(jié)核桿菌( M. bovis) 菌株全部缺失,2 個區(qū)域卡介苗及牛型結(jié)核桿菌菌株部分缺失。1 個區(qū)域所有卡介苗株全部缺失。4 個區(qū)域存在某種卡介苗株缺失。對于卡介苗菌株間的不同,Behr 認為那些在牛型結(jié)核桿菌存在而在卡介苗中缺失的H37Rv 的區(qū)域是在傳代過程丟失的。這些問題的解決對于疫苗評價以及改進有很大的意義,但用傳統(tǒng)的分子生物學方法是不可能完成的。

2. 菌株分子流行病學及疾病病因?qū)W研究:
傳統(tǒng)流行病學對于傳染病爆發(fā)中不同菌株的代謝分析、毒力分析、年代分析缺乏有效的手段。目前,大多數(shù)傳染病及地方病的病因已比較明確,但是,對于它們的分子機制卻了解很少。這主要是因為傳統(tǒng)的方法學的限制,無法用有限的人力、物力對大樣本量、多地區(qū)的信息在短時間內(nèi)進行分析。由于方法上的欠缺,使防疫工作者很難從分子機制上探討導致傳染病爆發(fā)的菌株之間的異同,例如在歷史上幾次流行性感冒和霍亂的大流行,病原體有變異,但也有聯(lián)系,這對于這些疾病的今后防治有重要的指導意義�；�因芯片與傳統(tǒng)的流行病學方法相結(jié)合,恰恰解決了這個矛盾。

Fitzgerald 等[ 24 ]用芯片技術(shù)對葡萄球菌的基因組的進化進行了分析,發(fā)現(xiàn)大約22 %的基因?qū)ζ咸亚蚓�是可有可無的。同時這些基因的轉(zhuǎn)移在葡萄球菌的進化中起很重要的作用。對甲氧苯青霉素耐藥的葡萄球菌的mec 基因(一種抗 β2內(nèi)酰胺的基因) 被水平的轉(zhuǎn)移了5 次,說明抗甲氧苯青霉素的菌株進化了多次,而不是從單一的原始菌株進化而來。這就可以解釋在20 世紀70 年代流行的中毒性休克綜合征 ( TSS) 是由宿主環(huán)境的改變造成,而不是由一個基因譜的快速變化產(chǎn)生的一個新的亞型。此研究說明基因芯片能夠?qū)σ酝�流行病學不能回答的問題(如造成TSS 流行的具體原因) 進行回答。芯片的出現(xiàn)是對傳統(tǒng)流行病學缺陷的有力補充。Lu 等[ 25 ]在中國貴州等地對砷中毒性肝病的分子機制進行了研究。他們用cDNA 芯片對暴露在砷環(huán)境下6～10 年、已經(jīng)有部分砷中毒癥狀的人群進行研究。通過研究他們認為基因表達譜的變化在砷中毒性肝病及肝癌中起決定性作用。該研究對于大規(guī)模流行病的病因調(diào)查又開辟了新的途徑。

3. 傳染病的診斷與鑒別診斷:傳染病在流行病學中占有非常重要的地位,尤其是近年來性傳播疾病(STD) 、結(jié)核病等的死灰復(fù)燃和大量新發(fā)現(xiàn)傳染病的出現(xiàn),給各級防疫部門提出了嚴峻的考驗。在傳染病爆發(fā)中,傳統(tǒng)的流行病學研究從取樣、培養(yǎng)病原體到鑒別診斷,往往需要幾天時間,這對于傳染病的治療和控制極為不利。加之人員流動的頻繁和傳播機會的急劇增加,需要找到一種快速、方便方法進行診斷和鑒別診斷,而基因芯片恰恰能滿足以上要求。目前,在這方面已進行了初步的嘗試。Chizhikov 等[ 9 ]將部分沙門菌、志賀菌及埃希菌的毒力基因作為芯片上的探針,可以對以上三種菌進行檢測。另外,還出現(xiàn)了一些用于檢測HIV 及結(jié)核桿菌的芯片[ 10 ,11 ] 。但這還遠遠不夠。這些基因芯片的共同特點是檢測的探針少,所得到的信息少,只是對一種病原體或幾種相關(guān)的病原體的檢測,對于多種病原體的鑒別診斷仍未進行,應(yīng)當說它們只是診斷芯片的雛形。但是,由于基因芯片對于疫情爆發(fā)后快速的初步診斷、傳染病的監(jiān)控以及各地菌型變化的監(jiān)測有得天獨厚的優(yōu)勢,它以診斷快速、易攜帶及儲存方便而操作不需要太強的專業(yè)性等使基因芯片極易在地區(qū)及縣一級防疫部門推廣。目前,在這一領(lǐng)域還處于探索階段,但這是傳染病診斷中主要的發(fā)展方向之一。

三、存在的問題

盡管基因芯片技術(shù)已有許多方面的進步。但是在分子流行病學的具體應(yīng)用中仍存在一些問題:首先,探針的雜交也有一定的錯配率,從而產(chǎn)生一定的背景,如何區(qū)分這種背景所造成的假陽性和由于傳染病樣品中由于拷貝數(shù)太低所造成的弱陽性,是傳染病診斷DNA 芯片面臨的主要挑戰(zhàn),由于在傳染病診斷DNA 芯片中采用的密度較低,因此它的這些缺點就不如高密度芯片那樣嚴重。但是,由于其結(jié)果往往伴隨著許多重大疫情的處理,診斷必須十分慎重。

另一種對應(yīng)用的限制來自芯片研究的成本。在芯片研究過程中,對樣品的標記及探針的制備都非常耗時、耗力。對病原微生物來說,由于絕大部分的病原微生物都是原核生物,它們的共同特點是沒有polyA 尾巴,因此無法象真核生物那樣通過polyA 尾巴純化mRNA ,并且用逆轉(zhuǎn)錄方法建立 cDNA 文庫。這就給制造芯片帶來很大的問題。Tao 等[ 26 ] 報道直接在混合的RNA 中(mRNA、tRNA、rRNA) 加入3’端的特異引物擴增cDNA 探針。但是,另一方面,與真核生物相比,病原微生物(原核生物或病毒) 的研究又有得天獨厚的優(yōu)勢。因為這些微生物的基因組都較小,只有幾千個ORF , 同時又沒有內(nèi)含子,這樣就可以通過對每個ORF 進行擴增, 用擴增產(chǎn)物代替cDNA ,制備探針。這種探針的另外一個好處就是它包含了病原微生物所有的基因,這就避免了cDNA 文庫可能使某些基因遺漏的潛在問題。這樣雖然解決了建立cDNA 文庫的問題, 但是, 以大腸埃希菌為例, 4 290 個 ORF 就需要4 290個特殊的引物,這大大的增加了科研難度和成本。因此,如何方便、快捷的建立病原微生物的檢測探針是基因芯片研究中亟待突破的瓶頸。隨著新技術(shù)的不斷出現(xiàn),基因芯片的成本將會越來越低。

第三,樣品的獲得與處理。對于傳染病診斷芯片來說,
樣品的來源廣泛并且混雜有各種各樣的干擾因素。在實際推廣過程中,要使廣大防疫部門在很短的時間內(nèi)、在廣大農(nóng)村地區(qū)很快的獲得象實驗室中獲得的樣品是不可能的。因此,這就需要傳染病診斷芯片有很高的特異性和敏感性。如何正確的對樣品進行簡單的處理,使混雜因素降到最低是廣大防疫工作者所面臨的主要挑戰(zhàn)。

第四,對于數(shù)據(jù)的處理和應(yīng)用仍存在問題�；�因芯片的出現(xiàn)對生物信息學提出了新的要求,對于大量的數(shù)據(jù)需要新的方法來處理。同時,對于基因芯片所提供的信息也要求更精確的判斷。Tao 等[ 26 ]對大腸埃希菌的全基因序列制成的芯片檢測細菌生長在微量葡萄糖環(huán)境和含葡萄糖的Luria 肉湯環(huán)境中基因組表達方式。他們發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)基因的翻譯表達明顯上升,而細菌在葡萄糖缺乏的環(huán)境中一些基因的表達也上升。這么多的基因表達發(fā)生了變化,這使數(shù)據(jù)的分析和應(yīng)用變的很困難。更重要的是,許多基因同時變化可能使真正的原因被掩蓋,因為一個基因的變化往往導致一連串下游基因或調(diào)控基因全都發(fā)生變化,因此,如何找到真正引起這些連鎖反應(yīng)的基因是科研人員需要注意的問題。另一個問題是,由于絕大多數(shù)病原微生物都是原核生物,它們的mRNA 多為多順反子,即一條mRNA 可翻譯成多種相關(guān)蛋白,所以它的cDNA 就代表了多個基因。而且編碼這些蛋白的基因相互交錯,即使以每個基因作為探針,在雜交時也很容易發(fā)生假陽性。這就對結(jié)果的判斷帶來很大的不便。這就需要其他相關(guān)領(lǐng)域的共同研究和幫助,如基因組草圖的繪制、二維蛋白電泳等。

四、展望
從1991 年Fodor 提出芯片這個概念到現(xiàn)在,已有2 000 多篇各類與芯片有關(guān)的文章發(fā)表,其中絕大多數(shù)是在1999
年以后發(fā)表的。這說明基因芯片在最近二三年發(fā)展迅速,應(yīng)用廣泛。目前,對于基因芯片的研究朝著快速、高質(zhì)量、準確的方向高速發(fā)展。雖然基因芯片仍有許多問題有待解決,但其前景一片光明。在未來流行病學領(lǐng)域中,基因芯片將在以下幾個方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

1. 傳染病的快速診斷及監(jiān)測:未來的傳染病爆發(fā)后(尤其是大規(guī)模自然災(zāi)害爆發(fā)后) 的檢測主要依靠基因芯片的快速初篩及診斷,做到24 h 內(nèi)明確病因,為防疫工作者提供可靠的數(shù)據(jù),是指導控制疫情的必要手段。
2. 分子流行病學資料分析:對于一些病因機制不清、病原體相關(guān)資料缺乏的傳染病可以用基因芯片進行研究,為歷史上爆發(fā)的傳染病之間的聯(lián)系提供新的線索。
3. 病因及流行規(guī)律的探究:隨著人類基因組計劃的完成,使一些遺傳性疾病病因的分子機制得到了明確�；�因芯片的使用將對這些遺傳性疾病的流行機制的探討會有很大幫助。同時,基因芯片還可用于一些慢病(如腫瘤、慢性傳染病、原發(fā)性高血壓等) 的早期篩查及普查。這比用傳統(tǒng)的方法將更加準確、便宜、方便�？梢灶A(yù)見,基因芯片隨著成本的不斷降低、準確性的不斷提高,將成為流行病學研究中一個有力的工具。

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