陳華 ，劉樹(shù)滔 ，溫騰 ，原山武 ，久保田英博 ，饒平凡
(1．福州大學(xué)生物工程研究所，福建福州350002；2．日本ATI''''O公司技術(shù)開(kāi)發(fā)部，東京113—8425)
摘要：對(duì)第一向?yàn)檩d體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦雙向電泳(Iso—DALT)中若干影響分離效果的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了研究．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，瓊脂糖和尿素的純度明顯影響分離效果；加丙烯酰胺或碘乙酰胺保護(hù)經(jīng)二硫蘇糖醇還原的樣品中的巰基，可以顯著減少假斑點(diǎn)；厚度較薄的分離膠的分離效果較好；以瓊脂糖為兩性電解質(zhì)載體代替聚丙烯酰胺的第一向等電聚焦電泳使分子量1 Da以上蛋白質(zhì)得以分離．

關(guān)鍵詞：雙向電泳；載體兩性電解質(zhì)；實(shí)驗(yàn)條件

中圖分類(lèi)號(hào)：Q5—33；Q510．2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Efect of experimental conditions on the resolution of
the two-dimensional electrophoresis
CHEN }hla ，LIU Shu—taoI，WEN Teng’，HARAYAMA Takeshi ，KUBOTA Hidehiro2，RAO Ping—fanI
(1．Institute of Biotechnology，F(xiàn)uzhou University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)~jian 350002，China；2．The Department of R&D，
ATYO Corporation，Tokyo 113—8425，Japan)
Abstract：The efect of several experimental conditions on the result of ISO ——DALT was investigated in
this paper．It was found that the purity of agarose and urea dramatically influenced the separation，the
addition of acrylamide or iodoacetamide into the sample reduced by DTI"could decrease the pseudo dots
of protein，thinner separating gel exhibited better efect，the replacement of agarose for polyacrylamide as
carrier of am phelyte could separate protein with molecular weight more than 1 Da．
Keywords：two— dimensional electrophoresis；carrier am phelyte；experimemal co ndition

雙向電泳方法按第一向等電聚焦的不同，可以分為載體兩性電解質(zhì)pH梯度雙向電泳和固相pH梯度雙向電泳．目前，載體兩性電解質(zhì)pH梯度雙向電泳方法由于蛋白溶解性低、重現(xiàn)性低、蛋白上樣量低，使其應(yīng)用受到限制n】．但固相pH梯度雙向電泳方法存在著固相膠條昂貴，固相pH梯度灌膠技術(shù)復(fù)雜，并且只能用聚丙烯酰胺做載體，不能分離分子量大于lo''''Da的蛋白質(zhì)等問(wèn)題．因此，第一向?yàn)檩d體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦(ISO—DALT)的雙向電泳方法仍有其存在的合理性和改進(jìn)的必要性．對(duì)蛋白質(zhì)雙向電泳雙胺染色法的研究發(fā)現(xiàn) 】，含有Na2 S20，非雙胺染液染色后膠表面背景深，星褐黃色，影響蛋白質(zhì)點(diǎn)檢測(cè)，特別影響低表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)檢測(cè)．不含Na2 S20，雙胺染液染色膠表面無(wú)任何背景，蛋白質(zhì)點(diǎn)異常清晰．但該研究并未對(duì)試劑純度(如瓊脂糖和尿素)、分離膠的厚度、樣品經(jīng)還原處理后巰基的保護(hù)和兩性電解質(zhì)載體等影響因素進(jìn)行進(jìn)一步的分析．為此，作者比較分析了影響其電泳效果的若干因素，找出提高該方法分離效果和范圍的途徑，從而提高該方法的可用性．

1 材料和方法
1．1 材料、試劑和儀器
利樂(lè)裝市售牛奶，雞卵黃免疫球蛋白(IgY)粗品，肝細(xì)胞．兩性電解質(zhì)Ampholine(pH 3．5—10，pH 4—6．5)和進(jìn)口等電聚焦瓊脂糖均購(gòu)自Amemham Biosciences；
收稿日期：2005—01—18
作者簡(jiǎn)介：陳華(1977一)，女，碩士研究生；通訊聯(lián)系人：劉樹(shù)滔，副教授．

D一山梨醇(High Pure)、N，N’一甲叉雙丙烯胺、CHAPS、TEMED、SDS、Glycine和Triton均購(gòu)自生物工程上海有限公司；進(jìn)口尿素(Ultra Pure)、Tris和D，I’I’均購(gòu)自BIO BASIC INC；國(guó)產(chǎn)瓊脂糖購(gòu)自BIOASIALtd．；低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)購(gòu)自上海東風(fēng)制藥廠；國(guó)產(chǎn)丙烯酰胺(化學(xué)純)．其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純．雙向電泳(ATro公司，AE一7341和AE一6541)，全自動(dòng)交流穩(wěn)壓電源(中國(guó)天正集團(tuán)有限公司)，超純水儀器(法國(guó)MILLIPORE)，離心機(jī)(飛鴿牌TDL一5一A)，掃描儀(EPSON perfection 1200 PHOTO)．

1．2 方法
市售利樂(lè)裝牛奶用蒸餾水?dāng)嚢柰肝鲞^(guò)夜，4℃保存．蛋黃液用蒸餾水7倍稀釋?zhuān)��?jīng)一20℃冷凍處理6 h后，于20℃以下的溫度解凍，添加3％硅藻土，在3 Pa(400 ml''''n Hg)真空度下，以0．45 m的混合纖維素脂膜為載體抽空過(guò)濾，將所得濾液水溶性組分調(diào)整至含有75 mmol／L磷酸鈉緩沖液pH7．0后，上樣到DEAE Toyopearl 650 M陰離子交換色譜，用150 mmol／L磷酸鈉緩沖液pH7．0洗脫，經(jīng)SDS—PAGE檢驗(yàn)為單一組成．凍成干粉，4℃保存．大鼠肝臟取出用PBS沖洗，稱(chēng)重，放置在冰上用手術(shù)剪剪碎，加入l0倍量的淋洗液(50 mmol／L Tris— HC1 pH 8．0，0．1M NaC1，0．1M EDTA)，再加入蛋白酶K 100／zL(100 mg／L)，去除細(xì)胞膜后得到肝細(xì)胞內(nèi)容物．溶液配置、樣品處理、第一向等電聚焦，SDS—PAGE和固定，染色，脫色，以及掃描參見(jiàn)文獻(xiàn)[3]．

2 結(jié)果
2．1 試劑純度的比較
用牛奶做材料，分別以進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)瓊脂糖、尿素為載體進(jìn)行等電聚焦，結(jié)果(圖1)顯示，牛奶中蛋白含量主要是酪蛋白和乳清蛋白，平均分子量為2×105 Da左右，酪蛋白等電點(diǎn)為4．6，有口．．，口 ，盧和4種類(lèi)型，乳清蛋白等電點(diǎn)為5．2，有口和 2種類(lèi)型．在2張電泳圖上均可看見(jiàn)兩個(gè)清晰的斑點(diǎn)，其中1為酪蛋白，2為乳清蛋白，縱向上與這兩點(diǎn)相平行的條帶分別為兩種蛋白的不同類(lèi)型．


從圖1可以看出，使用進(jìn)口瓊脂糖電泳(圖l(a))形成的1和2兩個(gè)斑點(diǎn)較圓，而使用國(guó)產(chǎn)瓊脂糖形成(圖l(b))的同樣兩個(gè)斑點(diǎn)則有橫向拖尾現(xiàn)象．另外，用電阻值為14 Mr2的水制備等電聚焦膠條時(shí)，用進(jìn)口瓊脂糖配膠可固化成型，而用國(guó)產(chǎn)瓊脂糖配膠不能固化成型或膠質(zhì)過(guò)軟，改用電阻值為18 Mgl的Mili—Q水，國(guó)產(chǎn)瓊脂糖配膠亦可固化成型．由此可見(jiàn)，進(jìn)口瓊脂糖優(yōu)于國(guó)產(chǎn)瓊脂糖．比較進(jìn)口尿素(圖1(c))和國(guó)產(chǎn)尿素(圖1(d))對(duì)電泳結(jié)果的影響，可以看到，使用進(jìn)口尿素進(jìn)行電泳形成的1和2兩個(gè)斑點(diǎn)較圓，而使用國(guó)產(chǎn)尿素形成的1和2兩個(gè)斑點(diǎn)也有橫向拖尾現(xiàn)象，且清晰度下降．可見(jiàn)，不同來(lái)源的試劑對(duì)分離結(jié)果有影響，進(jìn)口尿素分離效果要優(yōu)于國(guó)產(chǎn)試劑．進(jìn)口試劑(瓊脂和尿素)優(yōu)于國(guó)產(chǎn)相應(yīng)試劑的原因可能是，進(jìn)口試劑相比國(guó)產(chǎn)試劑純度高、離子含量較低．另外，電阻值高的水，由于離子含量少，可以縮短凝膠固化時(shí)間．

2．2 還原樣品中巰基的影響
圖2、圖3分別為肝細(xì)胞樣品和牛奶樣品加還原劑后加與不加巰基保護(hù)劑的電泳結(jié)果比較．與圖2(a)、圖2(b)比較，圖2(c)斑點(diǎn)數(shù)量明顯減少，還出現(xiàn)一些假斑點(diǎn)．與圖3(a)比較，圖3(b)點(diǎn)2和3消失，也出現(xiàn)4和5兩個(gè)假斑點(diǎn)．斑點(diǎn)減少是因?yàn)榧舆�原劑打開(kāi)二硫鍵后形成的巰基若未及時(shí)保護(hù)，會(huì)很快重新形成二硫鍵，出現(xiàn)假斑點(diǎn)是因?yàn)槎�硫鍵打開(kāi)后部分巰基交叉形成新的二硫鍵．因此，若使用還原劑處理樣品，應(yīng)及時(shí)加入巰基保護(hù)劑，以避免斑點(diǎn)減少并出現(xiàn)假斑點(diǎn)．以往樣品經(jīng)還原處理后，不再加試劑保護(hù)形成的巰基，一般認(rèn)為這種做法對(duì)蛋白的電泳分離效果并無(wú)影響，但經(jīng)本次試驗(yàn)可明顯看出樣品還原處理后保護(hù)形成的巰基是十分必要的，否則很有可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的分析結(jié)果．

2．3 第二向SDS—PAGE中分離膠厚度的影響
袁泉等人曾使用固定pH梯度(IPG)凝膠雙向電泳系統(tǒng)觀察同一個(gè)樣品在不同大小的第二向凝膠系統(tǒng)(大型和中型凝膠)的雙向電泳圖，認(rèn)為分離效果有較大差異 ．筆者采用的小膠是300 V下電泳45 min，大膠是120 V、16～24 mA下電泳165 min，染色與脫色時(shí)間大膠均長(zhǎng)于小膠，小膠電泳電壓遠(yuǎn)高于大膠因而電泳時(shí)間明顯縮短，小膠比大膠薄因而染色和脫色時(shí)間少于大膠，并且分離效果優(yōu)于大膠，蛋白斑點(diǎn)更清晰，電泳效果見(jiàn)圖4．雖然膠變大有利于蛋白的分離，但膠的厚度變大，橫向擴(kuò)散效應(yīng)比薄膠明顯，與膠的長(zhǎng)度相比，膠的厚度成為影響分離效果的主導(dǎo)因素，因而厚膠分離效果不如薄膠．



2．4 載體為瓊脂糖時(shí)對(duì)分子量10萬(wàn)以上蛋白的分離雞卵黃免疫球蛋白IgY是大分子量蛋白，分子量約為15×105 Da，等電點(diǎn)為5．4—5．5．由于其分 子量較大，以聚丙烯酰胺為等電聚焦電泳載體無(wú)法將其區(qū)分．而改用瓊脂糖凝膠作為等電點(diǎn)電泳的分離載體，使傳統(tǒng)上用聚丙烯酰胺為等電聚焦電泳載體無(wú)法分離的大分子蛋白(M，>100 kDa，如雞卵黃免疫球蛋白(IgV))的點(diǎn)在雙向電泳圖上得到了確認(rèn)，說(shuō)明以瓊脂糖為載體可以分離100 kDa以上的蛋白質(zhì)，這是因?yàn)榄傊�糖凝膠孔徑比聚丙烯酰胺大．電泳效果見(jiàn)圖5．

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