(一)蛋白質電泳
1.請參照常規(guī)電泳操作.
2.分子量標準:
可選擇普通分子量標準或預染的分子量標準.在選擇預染的分子量標準時,要注意其優(yōu)點和缺點:
優(yōu)點: 在電泳過程中可監(jiān)控蛋白質分離狀態(tài); 可指示轉印中蛋白質的轉印效率.
缺點: 染料影響蛋白質移動速度;分子量測定略欠精確;影響蛋白質與膜的結合力.
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(二)蛋白質轉印
a) 膜的選擇:主要采用 NC膜和PVDF膜,其比較如下:


(尼龍膜和NC膜的特點相似,主要用于核酸雜交)
b) 膜的大小: 請根據膠的面積來確定.
c) 膜的孔徑: 0.45um適用一般蛋白質. 0.2um適用小分子蛋白質.
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(三) 蛋白質的顯示(大部分實驗不需要進行此步操作)
蛋白質染色的染料有很多種,各種的特點均不一樣.


(四)免疫檢測
有各種不同的免疫檢測方法.請注意選擇.方法不同,則所需的試劑也不同.如需方便,可選擇完整的試劑盒.
A.封閉膜:
這一步會影響結果的成敗和背景的強度.常用封閉劑為BSA和Tween20. 脫脂干奶粉不適合用于糖蛋白和生物素標記抗體.
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B.一抗: 根據目的蛋白質選擇.單抗或多抗均可.注意已變性蛋白質無法檢測,必須采用非變性膠電泳. 我司有 R&D, Genex, Santa Cruz等公司的原裝抗體或進口分裝抗體.具體請參見免疫學部分產品----第一抗體.
C.標記二抗: 根據一抗的來源選擇二抗.
購買信息: 請參見免疫學部分試劑---各種標記抗體
D.底物系統(tǒng): 采用常規(guī)底物或化學發(fā)光底物.
(1) 顯色法: 常用底物為BCIP/NBT或DAB .此法簡單,但靈敏度不高,并難以從膜上去除.
(2) 化學發(fā)光法: 目前比較常用的方法.靈敏度較高,檢測時可采用X光膠片或CCD成像系統(tǒng).
不同顯色方法產品比較如下:


推薦產品:
SuperECL Plus Western Blotting 超敏發(fā)光液
采用獨特的發(fā)光底物系統(tǒng)，是世界上最靈敏的ECL Western Blot 化學發(fā)光試劑。用于Western Blotting 條帶的熒光發(fā)光，檢測直接或間接標記辣根過氧化物酶HRP 的抗體及其關聯(lián)的抗原。由兩種溶液組成，使用前混合。SuperECL Plus 超敏發(fā)光液，價格低廉，靈敏度大大高出Amersham 和Santa Cruz 公司同類ECL 產品100 倍以上，也明顯高出Pierce 的SuperSignal West Pico 化學發(fā)光系統(tǒng)數倍，但背景更干凈，發(fā)光時間持久，可以長達10 小時以上。
特別適用于豐度極低而一般ECL 系統(tǒng)難于檢測的目的蛋白。
特點如下：
ж 靈敏度極高，可檢測10-100 fg 抗原。
ж 高信噪比，背境干凈。
ж 發(fā)光迅速。
ж 發(fā)光持續(xù)12小時以上。
ж 可在日光燈下進行發(fā)光操作。
ж 節(jié)省抗體(一抗1:2000－1:6000；二抗1:4000－1:10000)。
ж 儲存條件：4℃避光儲存一年，偶爾室溫放置數周不影響質量。

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美國Pierce公司化 學 發(fā) 光 底 物 系 列



4. Western Blotting檢測試劑盒
我們開發(fā)了此步免疫檢測的完整的試劑盒,即HRP標記的二抗檢測系統(tǒng)(含封閉液,洗液,底物,HRP/親和素-二抗),您只需準備好一抗,并選擇和一抗動物來源相應的試劑盒就可以.對于實驗來說,采用完整的試劑盒可以避免各種試劑的不匹比而帶來的結果不理想.
Western Blotting DAB顯色法檢測試劑盒
試劑盒的內容：
（1） 封閉試劑：10g蛋白質干粉2包。
（2） 濃縮抗體稀釋液：20ml×2瓶，為10倍濃縮液。
（3） 過氧化物酶標記二抗。1ml。效價1：200—400
（4） DAB濃縮液10ml(×40倍)
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注: 每盒足夠10張膜或800平方厘米的膜顯色, 表中所列動物IgG是指一抗的種屬來源.