何龍飛1 、2 　沈振國1 劉友良1 　王愛勤2 (1 南京農業(yè)大學農學系,南京210095 　　2 廣西大學農學院,南寧530004 )
　　
膜片鉗技術(patch2clamp technique ,PC) 是原西德馬普所Erwin Neher 和Bert Sakmann 于1976 年發(fā)明的,他們首先將此技術應用于神經細胞的乙酰膽堿受體通道的研究,由于他們對這一技術及其在醫(yī)學研究中的應用作出了杰出貢獻,而榮獲1991 年諾貝爾醫(yī)學獎。八十年代以來,經過Hamill 等的進一步完善,加上原生質體、液泡等分離技術的成熟,膜片鉗技術在植物細胞膜生物學和分子生物學研究得到廣泛應用,并取得了豐碩成果。

1 　膜片鉗技術原理
膜片鉗技術是從一小片(約幾平方微米) 膜獲取電子學方面信息的技術,即保持跨膜電壓恒定— 電壓鉗位,從而測量通過膜離子電流大小的技術。進行膜片鉗測量時,將經過拋光的、尖端直徑為1 -2μm 的玻璃微吸管壓在經酶清潔的膜表面,形成高阻封接,電阻可達10 -100 GΩ。由于電性能完全絕緣,微吸管阻抗相對較低,背景噪音降低,在微吸管內充灌適當鹽溶液,同時施加電壓,對膜片進行電壓鉗位,此時,通過膜片離子通道的電流便流入微吸管,再由銀電極將該電流引入測量電路,再經過放大處理,便得到離子通道的離子流,從而能了解通過膜離子通道的離子運輸、信號傳遞等信息。
由于玻璃微電極與細胞膜之間的高阻封接非常穩(wěn)定和牢固,所以膜片鉗可以采用多種測量方式(圖1)


圖1 　膜片鉗的幾種測量方式
Cell2acttached :細胞粘附式
whole2cell :全細胞式　　
slow whole2cell :慢全細胞式
outside2out :外翻外式　　
inside2out :內翻外式

玻璃微吸管只是壓在膜表面的測量方式稱為細胞粘附式,在細胞粘附式基礎上,如在微吸管內作短暫的脈動抽吸,吸破膜片,使微吸管與胞內導電,就形成全細胞式,全細胞式能對常規(guī)微電極不能研究的許多小細胞進行研究。全細胞式又有慢全細胞式和快全細胞式之分,前者主要用于研究藥物對通道蛋白的影響,后者則用于研究細胞分泌。在全細胞式基礎上,抽起微吸管,在空氣中稍作停留,則可得到“內面向外和“外面向外的膜片,也稱“切割膜片”,這些小膜片在化學性質上被完全隔離,允許任意改變膜內、外離子環(huán)境, 觀察其對膜通道的影響,這種記錄模式分別稱為“內翻外式和“外翻外式。此外,還有“開放細胞吸附膜內翻外式(open cell2attched inside2out mode) ”和“穿孔囊泡膜外翻外(perforated vesicle outside2out mode) ”等模式。

膜片鉗記錄到的是通道電流。圖2 記錄到的是懸浮培養(yǎng)Chenopodi u m rubru m 細胞液泡SV 型通道的單通道電流。單通道電流由矩形脈沖構成,是持續(xù)無規(guī)則的,反映出小分子構象變化。向上電流表示通道開放,向下表示通道關閉,其持續(xù)時間即通道開放和關閉時間。電流變化幅度表示離子在給定時間內通過通道的數(shù)目。通道開放和關閉的持續(xù)時間依賴于所施加電壓和各種影響通道蛋白的因素(如Ca2 + 1p H1 第二信使、磷酸化作用) 。對開放和關閉時間間隔及電流大小等進行統(tǒng)計分析,可得到通道蛋白的分子動力學特點,如確定通道類型,開放通道平均數(shù)離子流量等。目前,膜片鉗技術的電流測量靈敏度已達P 安培(PA) 級,空間分辨率達1μm ,時間分辨率達10HS。

圖2 　Chenopodium rubrum 液泡膜SV 型通道的單通道電流記錄

2 　膜片鉗技術在植物膜生物學研究中應用
自從利用膜片鉗技術在植物細胞中證實離子通道的存在以來,膜片鉗技術以其特有的優(yōu)勢而被廣泛應用于植物膜生物學的研究。

物質運輸
早已了解到生物膜上主要有三種轉運蛋白:離子泵、通道和載體,但對它們在控制離子和代謝物質運輸中的作用和分工一直了解不多,因為對它們的活動難以進行區(qū)別,尤其是載體協(xié)助擴散運輸方式和離子通道都是沿濃度梯度或電位梯度進行的順勢流動,區(qū)別起來更為困難。利用膜片鉗技術已經能分辯出離子通道和載體間的差異:載體蛋白最大周轉率為104 -105 次/ 秒,即每秒鐘運輸104 -105 個離子;離子通道每秒可傳遞多于106 個離子,一個典型離子通道每秒可通過107 個離子,二者運輸速率相差100 -1000 倍[ 3 ] 。因此,應用膜片鉗技術可以區(qū)別物質通過膜的運輸方式。利用膜片鉗技術,已證實在植物細胞中存在許多種類離子通道,如K+ 通道、Ca2 + 通道、Cl -通道、NO3 -通道、有機酸離子通道(如蘋果酸) 等,并了解了其生理特性,加深了對植物進行營養(yǎng)物質吸收和運輸?shù)恼J識。

信號轉導
細胞信號轉導,尤其是逆境信息的感受和傳遞一直備受關注,但對其分子機制一直了解不多。近年來, 利用膜片鉗技術結合其它手段,大大加深了對這一問題的認識。逆境(如干旱、鹽) 脅迫下,通常引起植物葉片氣孔關閉,用膜片鉗和其它手段,已較清楚地了解這一過程的作用模式:逆境條件下,根尖合成ABA , 通過導管向地上運輸,到達葉片細胞質外體,ABA 激活保衛(wèi)細胞質膜上的非特異陽離子通道,Ca2 + 內流,使胞質Ca2 + 濃度增加,到達一定水平后,激活K+ 外流通道,引起K+ 迅速大量外流,蘋果酸含量下降,保衛(wèi)細胞膨壓喪失,氣孔關閉。
應用膜片鉗研究植物對病蟲害侵襲的防御反應也取得較大成功。用水稻特異激發(fā)子處理煙草時,真菌激發(fā)子誘導激活煙草細胞質膜上的Ca2 + 通道,提高通道開放機率,Ca2 + 內流增加,導致胞內Ca2 + 濃度上升, 激活植物防御反應系統(tǒng), 阻止細胞死亡, 接著, 胞質Ca2 + 繼續(xù)激活蛋白激酶,引起級聯(lián)反應,使質膜H+ ¬A TPase 再磷酸化,從而恢復正常細胞功能 。

細胞分泌
由于膜片鉗技術靈敏度高,用其并結合細胞生理學與分子生理學等技術來研究細胞分泌機制是非常新穎有效的手段。其原理在于細胞分泌的胞吐過程是在細胞膜上進行的,它會引起細胞形態(tài)的改變和物質流動,從而導致膜片參數(shù)發(fā)生變化,尤其是伴隨著分泌活性,整個細胞表面積(與膜電容成正比) 必然增加,通過測量細胞膜電容,便可估計單細胞的分泌活性[ 5 ] 。在動物細胞中,通過膜片鉗實驗,已初步得到了肥大細胞分泌調控模型、嗜鉻細胞分泌調控模型,而植物細胞則較少有報道,可能與植物細胞分泌時引起表面積變化相對較小,不易清楚區(qū)分有關,相信不久會有所突破。

分子生物學研究
膜片鉗技術也是研究轉運蛋白基因克隆、表達和功能分析的有效手段。將轉運蛋白基因的cRNA 注射入卵母細胞,在卵母細胞內便合成轉運蛋白,并以功能狀態(tài)整合到細胞膜上,再應用膜片鉗分析,便可證實該基因結構與功能間的一致性。如利用注入不同量KA T1 的cRNA 以控制KA T1 在卵母細胞中的表達, 膜片鉗記錄到K+ 內流量隨入cRNA 量增加而上升, 再加入外源的K+ 內流通道阻塞劑,發(fā)現(xiàn)其抑制常數(shù)隨注入的cRNA 量由015ng 增加到28ng 而增加了7 倍,說明KA T1 屬于K+ 內流通道[ 6 ] ,在此基礎上還可對其功能作進一步分析。用這一方法,對氨基酸、蔗糖、N H4 + 、脯氨酸等的轉運蛋白進行了深入的分析。

此外,膜片鉗技術還可用于轉運蛋白的遺傳特性、突變體和轉導植株分析 ,以及轉運蛋白分子運動、物質運輸?shù)膭恿�學性質的研究。