線粒體膜電位檢測試劑盒(Rhodamine 123) (Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with Rhodamine 123)是一種以Rhodamine 123為熒光探針對線粒體進(jìn)行染色并進(jìn)行膜電位檢測的試劑盒。本試劑盒可用于活細(xì)胞線粒體膜電位的檢測，也用于細(xì)胞凋亡的檢測。本試劑盒可使用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀等熒光檢測設(shè)備進(jìn)行檢測。

Rhodamine 123也稱2-(6-Amino-3-imino-3H-xanthen-9-yl)benzoic acid methyl ester，中文名為羅丹明123，分子式為C₂₁H₁₇ClN₂O₃，分子量為380.82，CAS號為62669-70-9。Rhodamine 123是一種通透細(xì)胞膜的黃綠色陽離子熒光探針，最大激發(fā)光波長為507nm，最大發(fā)射光波長為529nm。Rhodamine 123的化學(xué)結(jié)構(gòu)式和激發(fā)、發(fā)射光譜圖參考圖1。

圖1. Rhodamine 123的化學(xué)結(jié)構(gòu)式和激發(fā)、發(fā)射光譜圖。

本試劑盒檢測線粒體膜電位的原理如下。正常細(xì)胞中，Rhodamine 123能夠依賴線粒體跨膜電位進(jìn)入線粒體基質(zhì)，可發(fā)出明亮的黃綠色熒光；當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死時，線粒體膜電位丟失，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)持續(xù)開放，引起線粒體跨膜電位(ΔΨm)的崩潰，Rhodamine 123從線粒體中釋放出來，從而導(dǎo)致線粒體內(nèi)黃綠色熒光強(qiáng)度的明顯降低(Quench模式)。此外，Rhodamine 123探針在線粒體內(nèi)過度聚集后會出現(xiàn)自發(fā)淬滅現(xiàn)象，線粒體內(nèi)黃綠色熒光強(qiáng)度降低�？捎脽晒怙@微鏡、流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀等儀器檢測細(xì)胞，通過熒光信號的強(qiáng)弱來確定線粒體膜電位的變化和凋亡或壞死的發(fā)生。

Rhodamine 123可以快速通過細(xì)胞膜，僅需幾分鐘就可以被具有活性的線粒體所捕獲(sequestered by active mitochondria)，并且對細(xì)胞沒有明顯毒性。

本試劑盒可以應(yīng)用于大多數(shù)的哺乳動物細(xì)胞及酵母。由于Rhodamine 123在線粒體內(nèi)的積累依賴于線粒體膜電位，因此本試劑盒僅限用于存活的細(xì)胞或組織的檢測，不可用于固定或凍存的細(xì)胞或組織的檢測。

本試劑盒提供的Rhodamine 123為1000X溶液，該溶液經(jīng)過優(yōu)化，對大多數(shù)細(xì)胞都適用。但為了得到滿意的結(jié)果，對于不同類型的細(xì)胞請自行進(jìn)行一定摸索。Rhodamine 123的終濃度一般為0.1X-5X，最優(yōu)先的推薦終濃度為1X，染色時間通常為20~60分鐘。試劑盒提供的CCCP作為誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的陽性對照，終濃度一般為1-20μM，最優(yōu)先的推薦終濃度為10μM。同時，本試劑盒提供了檢測緩沖液，該緩沖液可在一段時間內(nèi)維持細(xì)胞的正常狀態(tài)，并給細(xì)胞提供一定的營養(yǎng)，效果比PBS或HBSS更好。使用本試劑盒檢測NRK-52E細(xì)胞線粒體膜電位變化的效果參考圖2。

圖2. 使用線粒體膜電位檢測試劑盒(Rhodamine 123)的檢測效果圖。正常的NRK-52E中，Rhodamine 123在線粒體內(nèi)聚集發(fā)出明亮的黃綠色熒光；使用CCCP誘導(dǎo)使線粒體膜電位下降后，線粒體內(nèi)黃綠色熒光強(qiáng)度明顯下降，幾乎完全消失。

本試劑盒小包裝C2008S，如果用于流式細(xì)胞儀，每個樣品的檢測體系體積為0.5ml時，可以進(jìn)行200次檢測；6孔板每孔檢測體系的體積為1ml時可以檢測100次，96孔板每孔檢測體系的體積為100μl時可以檢測1000次。
使用說明：
1.Rhodamine 123染色工作液的配制：
6孔板每孔所需Rhodamine 123染色工作液的量為1ml，其它培養(yǎng)器皿的Rhodamine 123染色工作液的用量以此類推；對于細(xì)胞懸液每50-100萬細(xì)胞需0.5ml Rhodamine 123染色工作液。取適量Rhodamine 123 (1000X)，按照每1µl Rhodamine 123 (1000X)加入1ml檢測緩沖液的比例稀釋Rhodamine 123，混勻后即為Rhodamine 123染色工作液。
注1：配制Rhodamine 123染色工作液時注意避光，且須現(xiàn)配現(xiàn)用，不能長期保存。
注2：本試劑盒中提供的檢測緩沖液含有Ca²⁺，能夠在一段時間內(nèi)維持細(xì)胞的正常狀態(tài)，并給細(xì)胞提供一定的營養(yǎng)，效果比PBS或HBSS更好；檢測緩沖液也可用細(xì)胞培養(yǎng)液代替，但培養(yǎng)液中不能含有血清，否則會影響Rhodamine 123的染色效果。
注3：染色工作液中Rhodamine 123的最終濃度需根據(jù)不同細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)體系通過預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。Rhodamine 123的推薦工作濃度為1X，可以在0.1X-5X范圍內(nèi)摸索最佳工作濃度。
2.陽性對照的設(shè)置：
把試劑盒中提供的CCCP (10mM)推薦按照1:1000的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，稀釋至10µM，處理細(xì)胞20分鐘。隨后按照下述方法加入Rhodamine 123染色工作液，進(jìn)行線粒體膜電位的檢測。對于大多數(shù)細(xì)胞，通常10µM CCCP處理20分鐘后線粒體的膜電位會完全喪失，Rhodamine 123染色后觀察應(yīng)呈弱黃綠色或幾乎無熒光；而正常的細(xì)胞經(jīng)Rhodamine 123染色后應(yīng)顯示明亮的黃綠色熒光。對于特定的細(xì)胞，CCCP的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資料或自行摸索確定。
3.對于懸浮細(xì)胞：
a.細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行一定處理后，計(jì)數(shù)。取適量細(xì)胞600×g室溫離心5min，棄上清，加入適當(dāng)體積的Rhodamine 123染色工作液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度約為1×10⁶/ml。
b.細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20-60min，不同的細(xì)胞最佳孵育時間不同。以20min作為初始孵育時間，對孵育時間進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化以得到最佳的效果。
c.37℃孵育結(jié)束后，600×g室溫離心5min，沉淀細(xì)胞。吸除上清，注意盡量不要觸及細(xì)胞。
d.用37℃預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌2次：加入1ml 37℃預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，600×g離心5分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清；再加入1ml 37℃預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，600×g離心5分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。
e.再用適量細(xì)胞培養(yǎng)液重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀分析。
4.對于貼壁細(xì)胞：
注意：對于貼壁細(xì)胞，如果希望采用熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測，可以先收集細(xì)胞，重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測方法。熒光酶標(biāo)儀如果能采用底讀的方式進(jìn)行熒光檢測，也可以使用96孔板等進(jìn)行貼壁培養(yǎng)檢測的。
a.對于6孔板的一個孔的細(xì)胞，吸除培養(yǎng)液，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)如有必要可以用PBS或其它適當(dāng)溶液洗滌細(xì)胞一次。
b.加入1ml Rhodamine 123染色工作液。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20-60min，不同的細(xì)胞最佳孵育時間不同。以20min作為初始孵育時間，對孵育時間進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化以得到最佳的效果。
c.37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌2次。
d.加入2ml預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。
e.熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。
5.對于純化的線粒體：
a.準(zhǔn)備好Rhodamine 123染色工作液。
b.0.9ml Rhodamine 123染色工作液中加入0.1ml總蛋白量為10-100µg純化的線粒體。
c.用熒光酶標(biāo)儀或熒光分光光度計(jì)檢測：混勻后直接用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行時間掃描(time scan)，激發(fā)波長為507nm，發(fā)射波長為529nm。如果使用熒光酶標(biāo)儀，可在軟件中把檢測對象設(shè)置為FITC，即可以檢測Rhodamine 123。另外，也可以參考下面步驟6中的波長設(shè)置進(jìn)行熒光檢測。
d.用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟6。
6.熒光觀測和結(jié)果分析：
Rhodamine 123的最大激發(fā)波長為507nm，最大發(fā)射波長為529nm。如使用熒光顯微鏡觀察，可以參考觀察FITC等其它綠色熒光時的設(shè)置。黃綠色熒光變?nèi)跽f明線粒體膜電位下降，并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。通過對比實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組測量的Relative fluorescence values (RFU)，可以得出藥物處理后線粒體內(nèi)Rhodamine 123探針熒光強(qiáng)度的變化。此處的陰性對照為僅含檢測緩沖液的未經(jīng)染色的細(xì)胞樣品。
注：流式檢測應(yīng)獲得兩個相對獨(dú)立的細(xì)胞群：明亮綠色熒光的正常細(xì)胞群和弱綠色熒光的凋亡或壞死細(xì)胞群。