【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：狂犬病毒檢測(cè)試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）
英文名稱：Rabies virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】 25T/盒 & 50T/盒
【預(yù)期用途】
本試劑盒適用于定性檢測(cè)狂犬病毒，不進(jìn)行病毒分型，可用于臨床狂犬病毒染的輔助診斷，但不作確診使用。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒針對(duì)手狂犬病毒基因組高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含狂犬病毒基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用熒光定量PCR儀對(duì)PCR過(guò)程中相應(yīng)通道信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析。
【主要組成成份】

序號(hào)	組成	25T/盒	50T/盒
1	狂犬病毒 RT-PCR反應(yīng)液	375 μL×1管	750 μL×1管
2	狂犬病毒 逆轉(zhuǎn)錄酶	50 μL×1管	100 μL×1管
3	狂犬病毒 Taq酶	75 μL×1管	150 μL×1管
4	狂犬病毒 陽(yáng)性對(duì)照	40 μL×1管	40 μL×1管
5	狂犬病毒 陰性對(duì)照	40 μL×1管	40 μL×1管
6	說(shuō)明書(shū)	1份	1份

注：陰性對(duì)照為人基因組DNA，陽(yáng)性對(duì)照為失去活性的狂犬病毒cDNA。
【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個(gè)月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1.組織樣品：無(wú)菌條件下取動(dòng)物組織（腦組織、角膜或皮膚組織）約0.5克于研磨管中，加入100 μL Trizol研碎，再加入500 μLTrizol制成懸液備用。
2.唾液、鼻咽洗液：生理鹽水漱口后，取唾液、鼻咽洗液等約5mL ，備用。
3.血液或血清樣品：使用無(wú)菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。
4.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。
5.樣本收集后可立即檢測(cè)；若不能立即檢測(cè)，可置于2～8℃冷藏過(guò)夜保存；如需長(zhǎng)期保存，標(biāo)本應(yīng)凍存于-70℃以下，避免反復(fù)凍融。
【檢驗(yàn)方法】
1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。
n =陰性對(duì)照數(shù)（1T）+陽(yáng)性對(duì)照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)

單反液配制表(每份)	RT-PCR反應(yīng)液	15.0 μL
	逆轉(zhuǎn)錄酶	2.0 μL
	Taq酶	3.0 μL

 (3)在無(wú)菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。
2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）
用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。
3.加樣
  在上述制備好的PCR反應(yīng)管中分別加入處理好的待測(cè)標(biāo)本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
   根據(jù)需要，在上述準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管中分別加入陰性對(duì)照品以及陽(yáng)性對(duì)照品各5 μl，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4. PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
 
 
 
 
 
 
 
 

反應(yīng)體積	25 μL	通道選擇	FAM通道采集狂犬病毒熒光信號(hào)
PCR 反應(yīng) 條件	步驟	條件	循環(huán)數(shù)
	反轉(zhuǎn)錄	42℃：10分鐘（min）	1
	預(yù)變性	95℃：3分鐘（min）	1
	預(yù)擴(kuò)增	95℃：5秒（s）	5
		55℃：40秒（s）
	PCR擴(kuò)增	95℃：5秒（s）	40
		55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)）

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽(yáng)性對(duì)照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對(duì)照：Ct值＞38或無(wú)Ct值，線形為直線或輕微斜線，無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期。
2.標(biāo)本結(jié)果判定：
（1）陽(yáng)性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期。
（2）可疑：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，則判定為陽(yáng)性，否則為陰性。
（3）陰性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值＞38或無(wú)Ct值。
【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

通道及檢測(cè)結(jié)果	標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果解釋
FAM
陰性（－）	標(biāo)本中未檢出狂犬病毒RNA
陽(yáng)性（＋）	標(biāo)本中檢測(cè)出狂犬病毒RNA

【檢驗(yàn)方法的局限性】

• 當(dāng)檢測(cè)樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最低檢出限時(shí)可能會(huì)發(fā)生假陰性的結(jié)果。
• 被檢樣本在采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過(guò)程中操作方式不當(dāng)容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
• 樣本在采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過(guò)程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽(yáng)性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最低檢出限為10² Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤5%。
【注意事項(xiàng)】

• 整個(gè)檢測(cè)過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格按照本說(shuō)明書(shū)要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行操作，各區(qū)實(shí)驗(yàn)服、儀器、耗材應(yīng)獨(dú)立使用，不能混用；實(shí)驗(yàn)用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作；三個(gè)區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置。
• 為避免RNA降解，樣本處理過(guò)程應(yīng)在0-4℃條件下操作，且完成實(shí)驗(yàn)后立即上機(jī)檢測(cè)；樣本處理過(guò)程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過(guò)無(wú)核酶處理。
• 每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)該設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照。
• 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時(shí)離心。
• 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽(yáng)性對(duì)照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)，并單獨(dú)存放。
• 為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記。
• 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說(shuō)明書(shū)相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置；不同批號(hào)試劑不能混用。
• ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。
• 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進(jìn)行無(wú)害化處理后方可丟棄。

       上海雅吉生物科技有限公司成立于2011年3月，是一家面向生命科學(xué)領(lǐng)域，科研機(jī)構(gòu)、高校、院所及企業(yè)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)研究提供所需要的科研類試劑、耗材、儀器、技術(shù)服務(wù)等。包括分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)，通過(guò)公司各個(gè)部門(mén)所有員工的共同努力在行業(yè)內(nèi)擁有較高知名度，深得新老客戶的厚愛(ài)，本著“優(yōu)質(zhì)、服務(wù)、信譽(yù)”的精神，堅(jiān)持以先進(jìn)的技術(shù)、優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品、良好的信譽(yù)，為國(guó)內(nèi)外廣大用戶提供優(yōu)質(zhì)生物產(chǎn)品和服務(wù)。公司在重視產(chǎn)品質(zhì)量的同時(shí)，也建立了一套集技術(shù)支持、物流、售后服務(wù)等多個(gè)部門(mén)聯(lián)動(dòng)服務(wù)體系，努力把我們方便、快捷、周到的服務(wù)提供給每一個(gè)客戶本研究所鄭重承諾：質(zhì)量保證、供貨及時(shí)、服務(wù)周到，公司總投資超過(guò)2000萬(wàn)元，并先后引進(jìn)了自動(dòng)化設(shè)備，組建了專業(yè)的研發(fā)技術(shù)團(tuán)隊(duì)。憑借著潔凈化的生產(chǎn)車間、標(biāo)準(zhǔn)化的質(zhì)量管理系統(tǒng)，為生產(chǎn)高質(zhì)量的產(chǎn)品提供了有效保證。
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