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銷售商: 西安百螢生物科技有限公司 | 查看該公司所有產(chǎn)品 >> |
貨號(hào) | 20609 | 存儲(chǔ)條件 | f/l |
規(guī)格 | 100 ug | ||
Ex (nm) | 492 | Em (nm) | 514 |
分子量 | 1048.9 | 溶劑 | DMSO |
產(chǎn)品詳細(xì)介紹 |
生物素和生物胞素與抗生物素蛋白和鏈霉親和素都具有高親和力結(jié)合。由于生物素和生物胞素是相對較小的分子,因此生物素和生物胞素可以與許多生物分子綴合而不會(huì)顯著改變靶分子的生物活性。Cal-520-生物素和Cal-520生物素結(jié)合物具有很好的鈣反應(yīng)。他們的抗生物素蛋白和鏈霉親和素復(fù)合物具有敏感的鈣反應(yīng)�?梢韵胂蟮氖牵梢詫al-520-生物素和Cal-520生物素結(jié)合物與IgG-抗生物素蛋白或IgG-鏈霉親和素結(jié)合物結(jié)合,以針對特定靶標(biāo)在空間上監(jiān)測鈣的變化。
使用Cal-520 AM,Cal-570 AM或Cal-630 AM酯類
1.使用Cal-520 ,Cal-590 或Cal-630 AM酯:
AM酯是非極性酯,其易于穿過活細(xì)胞膜,并且通過活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞酯酶快速水解。AM酯廣泛用于非侵入性地將各種極性熒光探針裝載到活細(xì)胞中。但是,使用AM酯時(shí)必須小心,因?yàn)樗鼈円子谒�,特別是在溶液中。它們應(yīng)在使用前重新配制成高質(zhì)量的無水二甲基亞砜(DMSO)。DMSO儲(chǔ)備溶液可以在-20℃下干燥儲(chǔ)存并避光。在這些條件下,AM酯應(yīng)穩(wěn)定數(shù)月。以下是我們推薦的將Cal-520 AM,Cal-590 AM或Cal-630 AM酯加入活細(xì)胞的方案。該方案僅提供指南,實(shí)際應(yīng)根據(jù)您的具體需求進(jìn)行修改。
a)在高質(zhì)量無水DMSO中制備2至5 mM Cal-520 AM,Cal-590 AM或Cal-630 AM酯的儲(chǔ)備溶液。
b)在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天,將Cal-520 AM,Cal-590 AM或Cal-630 AM溶解在DMSO中或?qū)⒌确莸闹甘緞﹥?chǔ)備溶液解凍至室溫。在Hanks和Hepes緩沖液(HHBS)或您選擇的緩沖液(0.04%Pluronic®F-127)中制備10至20μM的染料工作溶液。細(xì)胞加載所需指示劑的確切濃度必須憑經(jīng)驗(yàn)確定。
注意:非離子型洗滌劑Pluronic®F-127有時(shí)用于增加Cal-520 AM,Cal-590 AM或Cal-630 AM酯的水溶性。
c)如果您的細(xì)胞(如CHO細(xì)胞)含有有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,可將丙磺舒(1-2 mM)加入染料工作溶液中(最終濃度為0.5-1 mM)以減少滲漏去酯化指標(biāo)。
d)將等體積的染料工作溶液(來自步驟b或c)加入細(xì)胞板中。
e)將染料加載板在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育60至90分鐘,然后在室溫下將板孵育另外30分鐘。
注意:孵育染料超過2小時(shí)可以為某些細(xì)胞系提供更好的信號(hào)強(qiáng)度。
f)用HHBS或您選擇的緩沖液(含有陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑,如1mM丙磺舒,如果適用)替換染料工作溶液,以去除多余的探針。
g)在Ex / Em = 490 / 525nm(對于Cal-520 AM),540 / 5000nm(對于Cal-590 AM)或600 / 640nm(對于Cal-630 AM)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
2.測量細(xì)胞內(nèi)鈣響應(yīng):
為了確定溶液的游離鈣濃度或單波長鈣指示劑的Kd,使用以下等式:
[Ca]free = Kd[F ─ Fmin]/Fmax ─ F]
其中F是實(shí)驗(yàn)鈣水平下指示劑的熒光,F(xiàn)min是不存在鈣時(shí)的熒光,F(xiàn)max是鈣飽和探針的熒光。
解離常數(shù)(Kd)是探針對鈣的親和力的量度。 與校準(zhǔn)溶液相比,熒光指示劑的Ca結(jié)合和光譜性質(zhì)在細(xì)胞環(huán)境中變化非常顯著。 細(xì)胞內(nèi)指標(biāo)的原位反應(yīng)校準(zhǔn)通常產(chǎn)生顯著高于體外測定的Kd值。 通過在離子載體如A-23187,4-溴A-23187和離子霉素存在下將加載的細(xì)胞暴露于受控的Ca2+緩沖液來進(jìn)行原位校準(zhǔn)。 或者,細(xì)胞透化劑如洋地黃皂苷或X-100可用于將指示劑暴露于細(xì)胞外培養(yǎng)基的受控Ca2+水平。