細(xì)菌ATP生物發(fā)光法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

 

主要用途

 

細(xì)菌ATP生物發(fā)光法定量檢測試劑是一種旨在通過螢火蟲熒光素酶反應(yīng)系統(tǒng)，熒光素在酶的催化下，與ATP發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生生物光能，采用冷光儀測定其相對冷光單位的變化，來定量分析細(xì)菌樣品中ATP濃度的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細(xì)菌的ATP檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

 

技術(shù)背景

 

三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate；ATP）存在于所有代謝活躍的細(xì)胞內(nèi)，是細(xì)胞活力的標(biāo)志。一旦細(xì)胞死亡，ATP濃度急遽下降。螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）是62 kd 的單體蛋白，催化ATP依賴性熒光素（luciferin）的氧化，經(jīng)過電子轉(zhuǎn)移，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為氧化型熒光素（oxyluciferin）的光能，與ATP量成線性正相關(guān)，通過冷光儀（560nm）檢測，由此定量ATP濃度。其反應(yīng)方式為：

 

luciferase

ATP  +  D-Luciferin ＋ O2   →  Oxyluciferin  +  AMP ＋ PPi ＋ CO2 ＋ Light

            Mg²⁺

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

裂解液（Reagent A）  10毫升

緩沖液（Reagent B）  2.5毫升

反應(yīng)液（Reagent C）  250微升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）  50微升

產(chǎn)品說明書      1份

 

保存方式

 

保存在－20℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent C）嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品保存和標(biāo)準(zhǔn)液配制的容器

黑色96孔板：用于冷光檢測操作的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品沉淀

冷光儀：用于樣品冷光檢測

 

 

 

 

實驗步驟

 

• 待測樣品準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好待測細(xì)菌樣品 
• 進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)：在分光光度儀上測定OD600或直接計數(shù)
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入100微升預(yù)冷的裂解液（Reagent A）
• 置于冰槽里孵育30分鐘，期間每隔5分鐘渦旋震蕩5秒
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機離心20分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移出上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 放進(jìn)－70℃的冰箱里備用
• 或放進(jìn)冰槽里，繼續(xù)后續(xù)操作

 

• 標(biāo)準(zhǔn)樣品準(zhǔn)備

 

• 設(shè)置好冷光儀：溫度25℃，1秒延時（Delay），1秒整合（Integration）檢測。同時關(guān)上操作室的燈光
• 準(zhǔn)備好8個無菌的1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至8號管
• 按下表分別加入適量的裂解液（Reagent A）到每個離心管
• 移取5微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到1號管，混勻
• 小心移取50微升1號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到2號管，混勻
• 小心移取50微升2號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到3號管，混勻
• 小心移取50微升3號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到4號管，混勻
• 以此類推
• 將1至8號管放進(jìn)冰槽里備用；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

 

管號	裂解液（Reagent A）	標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）	標(biāo)準(zhǔn)ATP濃度
1	495微升	5微升	10－4摩爾/升
2	450微升	50微升1號管	10－5摩爾/升
3	450微升	50微升2號管	10－6摩爾/升
4	450微升	50微升3號管	10－7摩爾/升
5	450微升	50微升4號管	10－8摩爾/升
6	450微升	50微升5號管	10－9摩爾/升
7	450微升	50微升6號管	10－10摩爾/升
8	200微升	空白對照	0

 

• 活性測定

 

測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的緩沖液（Reagent B）置入冰槽里融化，然后移出500微升到新的1.5毫升離心管，加入50微升反應(yīng)液（Reagent C），輕柔混勻后，置于冰槽里，標(biāo)記為反應(yīng)工作液，放在暗室冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 準(zhǔn)備1個黑色96孔板，并做好標(biāo)記：包括背景空對照孔，標(biāo)準(zhǔn)樣品對照孔，以及待測樣品孔 
• 分別加入50微升裂解液（Reagent A）、稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）和待測樣品
• 分別加入50微升反應(yīng)工作液 
• 室溫下（25℃）孵育1分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)冷光儀檢測：1秒延時，1秒檢測
• 獲得相對發(fā)光單位（Relative Light Unit；RLU）：標(biāo)準(zhǔn)樣品對照孔或待測樣品孔RLU－背景空對照孔RLU
• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為相對發(fā)光單位（RLU）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)ATP濃度（摩爾/升）
• 計算樣品ATP濃度：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測算

 

注意事項

 

• 本產(chǎn)品為50次操作
• 本產(chǎn)品檢測敏感度達(dá)10^-12摩爾/升，即50至100細(xì)菌細(xì)胞（平均每個細(xì)菌含10^-13至-14摩爾ATP）
• 用戶根據(jù)實際情況，選擇5管標(biāo)準(zhǔn)區(qū)間范圍
• 所有操作均須無菌狀態(tài)下進(jìn)行
• 操作時，須戴手套
• 建議每個樣品安排3個孔，即重復(fù)3次，計算時取其平均值
• 反應(yīng)液（Reagent C）具有光高度敏感性，因此整個操作須避光進(jìn)行，避免反復(fù)凍融
• 由于ATP無處不在，且熱穩(wěn)定性。建議使用的槍頭、用具須嚴(yán)格無菌，避免重復(fù)使用；操作時避免污染試劑溶液，不得用手觸摸試劑容器的內(nèi)蓋
• 如果用戶沒有冷光儀，可以使用閃爍探測器（scitillation counter 或β計數(shù)器）替代，但敏感性較低
• 如果樣品ATP濃度較低，可以整合檢測至10秒
• 如果是注射式冷光儀，建議測試前后使用無離子水沖洗冷光儀注射（injector）管道
• 本公司提供系列ATP檢測試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

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