YIJI活體細(xì)胞線(xiàn)粒體膜通道孔（MPTP）紅色熒光（TMRM）檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

YIJI活體細(xì)胞線(xiàn)粒體膜通道孔（MPTP）紅色熒光（TMRM）檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)四甲基羅丹明甲酯染料，選擇性地聚集在線(xiàn)粒體內(nèi)呈現(xiàn)熒光染色，一旦釋放到細(xì)胞漿，即刻發(fā)生熒光淬滅，來(lái)分析和觀察線(xiàn)粒體膜通道孔活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種活體細(xì)胞線(xiàn)粒體（動(dòng)物、人體、昆蟲(chóng)等）膜通道孔活性（開(kāi)放狀態(tài)）的檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，活體檢測(cè)，分辨率高，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

線(xiàn)粒體膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由線(xiàn)粒體內(nèi)外膜成分構(gòu)成的非特異性且鈣離子依賴(lài)性通道。在細(xì)胞凋亡或壞死時(shí)，線(xiàn)粒體內(nèi)容物通過(guò)膜通道孔釋放到胞漿中。線(xiàn)粒體膜電位的去極化（depolarization），導(dǎo)致膜通道孔的開(kāi)放，顯著改變線(xiàn)粒體的通透性，使之線(xiàn)粒體膨脹（swelling），內(nèi)容物釋放。其中鈣離子過(guò)度進(jìn)入、線(xiàn)粒體谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等導(dǎo)致膜通道孔的持續(xù)開(kāi)放，而造成細(xì)胞色素C的釋放和線(xiàn)粒體膜電位的消失。四甲基羅丹明甲酯（tetramethylrhodamine methyl ester；TMRM），為羅丹明衍生物陽(yáng)離子染料，作為電勢(shì)測(cè)定（potentiometric）熒光探針：第一，具有親脂性的； 第二，與線(xiàn)粒體內(nèi)膜負(fù)電極結(jié)合而聚集；第三，容易進(jìn)入細(xì)胞及其線(xiàn)粒體。四甲基羅丹明甲酯進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)酯酶切離，產(chǎn)生四甲基羅丹明。四甲基羅丹明進(jìn)入線(xiàn)粒體后，被線(xiàn)粒體俘獲，呈現(xiàn)強(qiáng)烈熒光。一旦線(xiàn)粒體膜通道孔開(kāi)放，四甲基羅丹明釋放出來(lái)而在胞漿重新分布，其熒光性顯著降低。線(xiàn)粒體內(nèi)熒光的變化，表明膜通道孔的開(kāi)放狀態(tài)。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

YIJI清理液（Reagent A） 毫升

YIJI染色液（Reagent B） 微升

YIJI稀釋液（Reagent C） 毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1份

 

保存方式

 

保存YIJI染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

 

用戶(hù)自備

 

24孔細(xì)胞培養(yǎng)板：用于貼壁細(xì)胞染色的容器

1.5毫升離心管：用于染色工作液配制和細(xì)胞染色的容器

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀細(xì)胞

培養(yǎng)箱：用于染色孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于細(xì)胞熒光分析

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于細(xì)胞熒光定量分析

細(xì)胞流式儀：用于細(xì)胞熒光分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的YIJI染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，YIJI稀釋液（Reagent C）放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出xx微升YIJI染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升YIJI稀釋液（Reagent C），混勻后，在冰槽里靜置，并標(biāo)記為YIJI染色工作液，放在暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 貼壁細(xì)胞染色

 

• 準(zhǔn)備1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)24孔板的預(yù)處理后待測(cè)細(xì)胞（注意：可以使用載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和其它培養(yǎng)孔板，見(jiàn)注意事項(xiàng)8）
• 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
• 小心沿著孔壁加入xx微升37℃預(yù)熱的YIJI清理液（Reagent A）到1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
• 小心抽去清理液
• 小心沿著孔壁加入xx微升含有YIJI染色液（Reagent B）和YIJI稀釋液（Reagent C）的YIJI染色工作液到1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育20分鐘，避免光照
• 小心抽去YIJI染色工作液
• 小心沿著孔壁加入xx微升37℃預(yù)熱的YIJI清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)孔
• 小心抽去清理液
• 小心沿著孔壁加入xx微升37℃預(yù)熱的YIJI清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)孔
• 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：

（A）使用倒置熒光顯微鏡觀察（定性檢測(cè)）：

激發(fā)波長(zhǎng)540nm，散發(fā)波長(zhǎng)580nm――紅色熒光減弱，表明膜通道孔開(kāi)放活性（MPTP）增強(qiáng)

 

• 使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)（定量檢測(cè)）：

放進(jìn)熒光分光光度儀：激發(fā)波長(zhǎng)540nm，散發(fā)波長(zhǎng)580nm――RFU降低，表明膜通道孔開(kāi)放活性（MPTP）增強(qiáng)

 

• 懸浮細(xì)胞或脫離細(xì)胞染色

 

• 將預(yù)處理后懸浮細(xì)胞或脫離細(xì)胞（1 X 10⁶細(xì)胞）移入到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升37℃預(yù)熱的YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升含有YIJI染色液（Reagent B）和YIJI稀釋液（Reagent C）的YIJI染色工作液，充分混勻 
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育20分鐘，避免光照
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升37℃預(yù)熱的YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升37℃預(yù)熱的YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：
  • 進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析：激發(fā)波長(zhǎng)488nm氬離子激光，散發(fā)波長(zhǎng)570nm（FL2），觀察10000個(gè)細(xì)胞以上――

波峰左移，表明膜通道孔開(kāi)放活性（MPTP）增強(qiáng)

 

• 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測(cè)）：

1）移取10微升上述細(xì)胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片 

2）激發(fā)波長(zhǎng)540nm，散發(fā)波長(zhǎng)580nm――

綠色熒光減弱，表明膜通道孔開(kāi)放活性（MPTP）增強(qiáng)

 

• 或使用熒光分光光度儀檢測(cè)（定量檢測(cè)）：

1）移取500微升上述細(xì)胞懸液到1毫升比色杯

2）加入xx微升YIJI清理液（Reagent A）

3）上下傾倒混勻數(shù)次

4）放進(jìn)熒光分光光度儀：激發(fā)波長(zhǎng)540nm，散發(fā)波長(zhǎng)580nm――

RFU降低，表明膜通道孔開(kāi)放活性（MPTP）增強(qiáng)

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為20次（0.5毫升體系/次）操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 操作時(shí)，避免污染母液
• 染色前，所有試劑溶液，除YIJI染色液（Reagent B）外，需37℃預(yù)熱
• 建議細(xì)胞染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測(cè)分析
• 孵育時(shí)，必須避免光照
• 本產(chǎn)品友好使用于雙重染色或重疊染色
• 本產(chǎn)品適合各種規(guī)格的培養(yǎng)細(xì)胞：載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和各種培養(yǎng)孔板，須相應(yīng)調(diào)整處理液：

 

操作容器	建議操作體系
載玻片	100微升
載玻片培養(yǎng)皿	1毫升
35mm培養(yǎng)皿	1毫升
96孔培養(yǎng)板	100微升
48孔培養(yǎng)板	200微升
24孔培養(yǎng)板	500微升
12孔培養(yǎng)板	1毫升
6孔培養(yǎng)板	2毫升
25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶	3毫升

 

• 可以使用±10nm波長(zhǎng)的濾波器
• 可以使用100微摩爾CaCl2處理的樣品作為膜通道孔開(kāi)放的陽(yáng)性對(duì)照
• 如果膜通道孔為瞬時(shí)開(kāi)放（transient），則熒光緩慢且自發(fā)降低
• 本公司提供膜通道孔抑制劑：YIJI 0.2毫摩爾環(huán)胞素A（cyclosporine A）－GMS12226，維護(hù)熒光完整
• 本公司提供系列線(xiàn)粒體分析試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰

 

使用承諾

 

上海一基秉著“信譽(yù)至上、客戶(hù)滿(mǎn)意、質(zhì)量承諾”的宗旨為我們的用戶(hù)提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和服務(wù)。用戶(hù)收到貨后，應(yīng)按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷(xiāo)售前已作嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定，保證說(shuō)明書(shū)所述的使用效果。在貨到后10天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問(wèn)題，請(qǐng)立即以書(shū)面形式（實(shí)驗(yàn)報(bào)告）與本公司聯(lián)系，并將該產(chǎn)品退回，經(jīng)檢驗(yàn)確系產(chǎn)品質(zhì)量所致，本公司負(fù)責(zé)更換產(chǎn)品。如系使用者錯(cuò)誤操作所致，本公司不承擔(dān)由此造成的損失。

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