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STELLARIS首秀-多重拍攝解鎖SARS-CoV-2致病機制

瀏覽次數:8416 發(fā)布日期:2020-11-30  來源:徠卡顯微系統(tǒng) 張覺超

今年6月,徠卡共聚焦新產品STELLARIS在上海啟動了國內首秀,隨后開啟了其在全國多地的巡展。上市巡展還沒結束,STELLARIS用戶群中的首篇研究論文就已悄然成稿。該研究由法國巴斯德研究所的病毒學家Lisa A. Chakrabarti團隊完成,聚焦在當下全球熱點——SARS-CoV-2的致病機制。接下來,我們就來聊聊這篇題為“SARS-CoV-2 infection damages airway motile cilia and impairs mucociliary clearance”的文章[1],順便看看作者用到了哪些STELLARIS共聚焦的拍攝“技能”。

研究概覽

SARS-CoV-2(嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2, 又稱新型冠狀病毒或COVID-19)病毒的“爆發(fā)”無疑是2020年的頭號國際公共衛(wèi)生緊急事件。研究表明,SARS-CoV-2病毒比2002/03年的非典病毒(SARS-CoV-1)具有更高的有效傳播率,對人類健康構成了重大威脅[2]。SARS-CoV-2感染早期階段上呼吸道上皮細胞中病毒的活躍復制是導致其高傳播率的主要原因之一[3]。對SARS-CoV-2患者的尸檢結果顯示,病毒主要在上下呼吸道上皮和肺泡中復制[4] 。

 

目前,我們對SARS-CoV-2感染影響上皮細胞功能的機制知之甚少。為了揭示SARS-CoV-2從上呼吸道向肺深部擴散的致病機制,作者在人支氣管上皮體外重建模型中研究了SARS-CoV-2與其主要靶細胞的相互作用方式,分析了SARS-CoV-2感染引起細胞的超微結構和功能變化。研究結果表明SARS-CoV-2感染早期會引發(fā)氣道上皮結構中纖毛層(Ciliary layer)的破壞,致使纖毛運動能力減弱,導致黏膜纖毛(Mucociliary)局部清除障礙。局部纖毛的損傷可減緩病毒向咽部的運輸,增加其進入支氣管系統(tǒng)更深區(qū)域的幾率,直到進一步感染肺泡并引發(fā)肺細胞的損傷。
 

呼吸道上皮

呼吸道上皮主要由3種細胞(杯狀細胞、纖毛細胞和基底細胞)組成(圖1),在機體抵御感染時發(fā)揮著關鍵的作用。其中,杯狀細胞(Goblet cells)可以分泌一種保護性黏液(mucus),能夠捕獲吸入的微粒(包括微生物)。而纖毛細胞(Ciliated cells)的數量最多,占上皮細胞的一半以上,因每個細胞頂端約有200根纖毛而得名。纖毛細胞頂端的纖毛以一種協調的方式有節(jié)奏地擺動,導致其表面的黏液層持續(xù)地向喉咽方向移動,最終被吞咽[5]。這種黏液纖毛清除的機制能有效阻止吸入的微粒在肺部的積聚。基底細胞(basal cells)位于呼吸道上皮基底膜附近,在上皮損傷的刺激下可以增殖并分化為其他類型的上皮細胞。

 

圖1 呼吸道上皮模式圖
 
 

研究過程

研究圍繞SARS-CoV-2對呼吸道上皮的感染過程展開。作者選用人的呼吸道上皮體外重建模型(MucilAir™模型,EPITHELIX公司)進行研究(圖2A)。支氣管上皮細胞在空氣/液體界面(ALI)分化了4周后,作者通過掃描電鏡確定了模型中支氣管上皮細胞分化為假復層上皮,包括杯狀細胞、纖毛細胞和基底細胞三種主要的細胞類型(圖2B)。隨后,作者用SARS-CoV-2病毒懸液(106pfu/mL)感染重建的上皮組織4小時并監(jiān)控病毒RNA、TCID50(半數組織培養(yǎng)感染劑量)、細胞緊密連接、TEER(跨上皮電阻)等指標,最終確認從病毒感染到組織損傷后部分恢復病毒清除能力的時間窗口為7天(詳細結果見論文原稿)。

圖2 呼吸道上皮體外重建MucilAir™模型

A,模型示意圖;B,分化4周后透射電鏡檢測圖。

隨后,該STELLARIS出場了,作者檢測病毒感染的主要細胞為β-tubulin陽性的纖毛細胞(圖3A)。利用共聚焦顯微鏡對假復層上皮的縱向掃描結果顯示SARS-CoV-2對纖毛上皮細胞有優(yōu)先的趨向性(圖3B)。隨后的電鏡結果也顯示SARS-CoV-2病毒對纖毛層有很強的破環(huán)作用(圖3E、F)。

圖3  SARS-CoV-2感染導致運動纖毛喪失

A,SARS-CoV-2感染后2天纖毛層共聚焦檢測結果(β-tubulin標記纖毛細胞,spike標記病毒顆粒);B,SARS-CoV-2感染后4天假復層上皮共聚焦XZY掃描結果(Cytokeratin-5標記基底細胞);E & F,掃描電鏡圖像。

為了進一步確認SARS-CoV-2病毒破壞纖毛的機制,作者通過共聚焦進行了感染前后纖毛微管遠端/近端峰值比率的測定(圖4A、B)。結果顯示,SARS-CoV-2病毒感染兩天后纖毛通常呈現出縮短和畸形,其微管信號的遠端/近端峰值比顯著低于未感染的細胞。透射電鏡的結果顯示,SARS-CoV-2感染通過誘導軸突(Axoneme)的丟失和基底小體(Basal body)錯位破壞原有的纖毛結構(圖4E-H)。

圖4 SARS-CoV-2感染導致纖毛結構破壞

A,纖毛層共聚焦XZY模式圖像和熒光定量分析結果(β-tubulin標記纖毛細胞,spike標記病毒顆粒);B,纖毛β-tubulin遠端/近端峰值比統(tǒng)計圖;E-H,透射電鏡圖像(其中bb: basal body; ax: axoneme; rt: rootlet; vp: viral particles; lp: large particle)。

接下來,作者用時間序列拍攝檢測SARS-CoV-2感染對上皮體外重建模型微粒清除能力的影響(圖5A、B)。結果顯示,SARS-CoV-2感染不僅影響纖毛擺動的方向(圖5C、D)和速度(圖5E),還影響纖毛擺動的協調性(圖5F,徑直度)。換句話說,SARS-CoV-2感染導致的纖毛損傷能顯著降低呼吸道上皮的黏膜纖毛清除能力。

圖5 SARS-CoV-2感染導致纖毛喪失黏膜纖毛清除能力

微球在纖毛層運動軌跡圖(A & B)、方向和幅度分析圖(C & D)、平均速度統(tǒng)計圖(E)以及徑直度統(tǒng)計圖(F)。

最后,作者在體外(上皮重建模型)和體內(金黃色敘利亞倉鼠模型)研究中對SARS-CoV-2感染后的呼吸道應激修復能力進行檢測。結果顯示,感染7天后上皮重建模型中基底細胞的密度增加,部分向纖毛細胞轉變(圖6A-C),培養(yǎng)體系內IFN表達水平上升(結果見論文原稿)。說明SARS-CoV-2感染可觸發(fā)上皮防御和修復機制。在金黃色敘利亞倉鼠模型中,基底細胞的形態(tài)轉變則跟SARS-CoV-2感染時病毒的計量正相關(圖6E)。至此,作者根據研究得到的結論和已有研究成果推定:SARS-CoV-2感染后固有的上皮防御和修復機制可能發(fā)生得太晚,來不及阻止病毒在呼吸樹(Respiratory tree)中的傳播和繼發(fā)性感染的發(fā)生。

圖6 SARS-CoV-2感染后基底細胞參與上皮組織損傷修復

A,SARS-CoV-2感染后7天假復層上皮共聚焦XZY掃描結果(β-tubulin標記纖毛細胞,spike標記病毒顆粒Cytokeratin-5標記基底細胞);B & C,沿Z軸定量細胞角蛋白-5密度分布和統(tǒng)計圖;E,金黃色敘利亞倉鼠氣管組織共聚焦圖像(感染后4天)。
 
  

STELLARIS“技能”盤點

下面我們來盤點一下研究過程中作者用到了STELLARIS的哪些技能:

  • XZY(正交視圖)模式。坐頭把交椅的就是XZY拍攝模式,即正交視圖(orthogonal view)拍攝模式。作者要呈現支氣管上皮組織中三種細胞的分布情況,而XZY模式下能采集得到樣本正交視圖(XZ方向的圖像)。所以,文中幾個關鍵的圖像數據作者給出的都是XZ圖像。另外,在STELLARIS上,我們可以很方便的利用XZY模式實現樣品焦平面的精確定位。

  • 多色高清圖像采集。同時將微管蛋白、病毒顆粒、角蛋白和細胞核在一張圖片上展示,讓讀者直觀看到3種細胞的位置分布,作者就是應用了共聚焦的多色成像能力。而STELLARIS的多色成像能力遠不止于此。機器標配的HyDS高靈敏檢測器,檢測范圍覆蓋410-850 nm發(fā)射光波段,在傳統(tǒng)的4色檢測實驗設計上,可以輕松擴展到6色。而雙重制冷的加持更是讓HyDS檢測器能輕松應對超分辨率高清成像的需求。配合STELLARIS標配的Lightning超分辨模塊,能幫助我們實現XY方向120nm、Z方向200nm的多色超高分辨率成像。

  • XYT(時間序列)模式。在STELLARIS上也能輕松追蹤細胞、囊泡或顆粒的運動軌跡。用戶不僅能通過圖像分析功能得到運動軌跡圖,還可以通過DSE(動態(tài)信號強化)技術得到信噪比和清晰度好的圖像。

  • Navigator(導航式拼圖)模塊。想在展現樣本全貌圖像的同時得到清晰的單個視野圖像?Navigator了解一下。集拼圖拍攝和圖像無縫拼接于一身,微觀到宏觀一覽無余。配備FocusMap功能,拍攝范圍再大都不“失焦”。

 

雖然文中沒有用到,但不能不提STELLARIS的獨門“技能”——TauSence模塊[6]。在徠卡多個專利技術的加持下,STELLARIS成功實現將熒光壽命維度引入共聚焦成像平臺。與傳統(tǒng)共聚焦相比,STELLARIS能幫助您多一個維度獲得樣品圖像、輕松避免串色、進一步擴展多色實驗設計(基于熒光壽命)、實現樣品組分拆分……優(yōu)點實在太多(詳細資料敬請回顧徠卡顯微系統(tǒng)公眾號往期文章)。

結語
應用STELLARIS的研究論文秀才剛剛拉開帷幕,后面STELLARIS會為大家展示更加豐富的成像“技能”,幫助用戶“Get Closer to the Truth”!徠卡STELLARIS共聚焦顯鏡接下來還會繼續(xù)舉辦全國范圍內的上市巡展,歡迎大家前來體驗STELLARIS的“十八般武藝”。

 

參考文獻:
[1] Rémy Robinot, Mathieu Hubert, Guilherme Dias de Melo, Françoise Lazarini, Timothée Bruel, Nikaïa Smith, Sylvain Levallois, Florence Larrous, Julien Fernandes, Stacy Gellenoncourt, et al. (2020). SARS-CoV-2 infection damages airway motile cilia and impairs mucociliary clearance. BioRxiv.
[2] Petersen, E., Koopmans, M., Go, U., Hamer, D.H., Petrosillo, N., Castelli, F., Storgaard, M., Al Khalili, S., and Simonsen, L. (2020). Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. Lancet Infect Dis.
[3] Zou, L., Ruan, F., Huang, M., Liang, L., Huang, H., Hong, Z., Yu, J., Kang, M., Song, Y., Xia, J., et al. (2020). SARS-CoV-2 Viral Load in Upper Respiratory Specimens of Infected Patients. N Engl J Med 382, 1177-1179.
[4] Hou, Y.J., Okuda, K., Edwards, C.E., Martinez, D.R., Asakura, T., Dinnon, K.H., 3rd, Kato, T., Lee, R.E., Yount, B.L., Mascenik, T.M., et al. (2020). SARS-CoV-2 Reverse Genetics Reveals a Variable Infection Gradient in the Respiratory Tract. Cell.
[5] Spassky, N., and Meunier, A. (2017). The development and functions of multiciliated epithelia. Nat Rev Mol Cell Biol 18, 423-436.
[6] Application Note. (2020). TauSense: a fluorescence lifetime-based tool set for everyday imaging. Nat Method.



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