在生物制藥行業(yè)，連續(xù)制造通常被認(rèn)為是提高生物生產(chǎn)效率的方法。與批處理相比，它可以在更小的設(shè)備內(nèi)生產(chǎn)更多的產(chǎn)品，同時(shí)提高產(chǎn)品質(zhì)量，尤其是對(duì)敏感和不穩(wěn)定的分子。對(duì)上游和下游操作進(jìn)行連續(xù)方法的相關(guān)調(diào)查表明：為將連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)充分實(shí)現(xiàn)，即細(xì)胞培養(yǎng)、收獲和產(chǎn)品純化必須有效地集成。這是行業(yè)內(nèi)的趨勢(shì)：將包括生物生產(chǎn)和生物過(guò)程的平臺(tái)包括種子生物反應(yīng)器等過(guò)程視為一個(gè)整體，統(tǒng)籌處理。

細(xì)胞培養(yǎng)操作在確定整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。在過(guò)去幾十年中，該行業(yè)在從補(bǔ)料分批培養(yǎng)中獲得更高的產(chǎn)品效價(jià)方面取得了很大的進(jìn)展。其中一個(gè)結(jié)果是向更小的生物反應(yīng)器邁進(jìn)，用一次性技術(shù)取代舊的不銹鋼設(shè)備。一些公司選擇發(fā)展灌注過(guò)程。他們是尤其是在生產(chǎn)不穩(wěn)定，半衰期短的治療產(chǎn)品過(guò)程中，優(yōu)勢(shì)明顯。

在灌注控制下，蛋白質(zhì)可以不斷地從培養(yǎng)容器中提取并在降解前純化。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷增加和有毒代謝物的去除，使灌注培養(yǎng)能夠在數(shù)周內(nèi)達(dá)到，并維持高的細(xì)胞密度。這不僅是一個(gè)高生產(chǎn)率的條件，而且還允許細(xì)胞保持在一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)，并表達(dá)一致性的產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)量的發(fā)展以及細(xì)胞過(guò)濾器強(qiáng)度的增加都為細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)起到了推動(dòng)作用。

然而，該技術(shù)仍然存在一些缺點(diǎn)，包括長(zhǎng)時(shí)間操作細(xì)胞培養(yǎng)的挑戰(zhàn)：例如，防止污染和在收獲和純化多批次過(guò)程中一致性的驗(yàn)證。這些問(wèn)題在新藥研發(fā)過(guò)程中尤為重要。因此，一些公司決定在采用灌注模式，通過(guò)保留新的培養(yǎng)基和通過(guò)超濾裝置去除被耗盡的培養(yǎng)基，從而收集產(chǎn)物（有時(shí)稱為濃縮進(jìn)料批處理模式）�？梢赃_(dá)到和維持非常高的細(xì)胞密度，在短時(shí)間內(nèi)提供很高的生產(chǎn)率，而不需要額外地對(duì)多個(gè)“子批次”進(jìn)行收集和純化。

然而，連續(xù)上游操作的全部潛力尚未全部挖掘。新技術(shù)的運(yùn)用，將臨床前，臨床，商業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的效率得到很大提高。由于可以達(dá)到如此高的滴度，一些熱銷的藥物也會(huì)采用2000L一次性生物反應(yīng)器進(jìn)行生產(chǎn)。這樣操作的優(yōu)點(diǎn)就是省略了一個(gè)額外的放大步驟，并以此消除與時(shí)間和進(jìn)一步調(diào)節(jié)過(guò)程中所產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。此外，藥物制造商可以利用灌注操作中，可以充分利用一次性反應(yīng)器的所有優(yōu)點(diǎn)。

 

生物反應(yīng)器接種和初始批處理階段后，使用細(xì)胞截留裝置，以恒定的收獲流速去除無(wú)細(xì)胞上清液。同時(shí)，等量補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。通過(guò)稱重傳感器接收信號(hào)的飼料泵或一個(gè)平臺(tái)平衡來(lái)實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基添加的控制，這樣操作員就可以保持一個(gè)確定的生物反應(yīng)器重量。多種方法可以使用，包括基于營(yíng)養(yǎng)水平來(lái)調(diào)整日常培養(yǎng)基添加量。

隨著細(xì)胞密度的增加，營(yíng)養(yǎng)消耗和代謝物的積累，需要提高新鮮培養(yǎng)基的交換率，或者，也就是每天遵循一個(gè)預(yù)設(shè)定程序進(jìn)行培養(yǎng)基交換。在線生物量測(cè)量，提供了一種基于細(xì)胞密度信號(hào)，從而控制灌注或細(xì)胞濾出率的自動(dòng)選擇方法。使用在線葡萄糖和乳酸測(cè)量的生物反應(yīng)器中，操作員通過(guò)添加濃縮飼料可以控制葡萄糖濃度。圖1中的示意圖顯示了一個(gè)典型的集中灌注或分批設(shè)置。

典型的灌注率下降到每天一至兩反應(yīng)器體積的范圍。采用較低的細(xì)胞濾出速度可以建立恒定的細(xì)胞生長(zhǎng)速率，并且可以維持高的存活率，進(jìn)而最大限度避免細(xì)胞截留裝置的堵塞。根據(jù)細(xì)胞截留膜的孔徑大小或截留率，蛋白質(zhì)產(chǎn)物將存在于在無(wú)細(xì)胞上清液（微濾灌注）中或保留在生物反應(yīng)器中（超濾灌注）。由于大多數(shù)抗體是相對(duì)穩(wěn)定的，所以在生物反應(yīng)器中直接灌注的策略，為這種產(chǎn)物的積累提供了一種簡(jiǎn)單而直接的方法，增加給定抗體制造設(shè)施的空間/時(shí)間產(chǎn)量。對(duì)于易降解的重組蛋白，微濾灌注是一種較好的選擇。那些可能表現(xiàn)出反饋抑制作用的產(chǎn)物，應(yīng)盡可能快地從細(xì)胞培養(yǎng)中分離出來(lái)，然后在隨后的純化過(guò)程中轉(zhuǎn)移到冷卻的收獲罐中。使用賽多利斯一次性攪拌槽生物反應(yīng)器（聯(lián)合多種尺寸的細(xì)胞截留裝置），可以在2L體積水平進(jìn)行灌注。例如，一個(gè)公司可以使用德國(guó)貝朗或b-dcu控制器，隨后規(guī)模擴(kuò)大過(guò)程至500L，1000L水平時(shí)，BIOSTAT STR系統(tǒng)。在1000升和2000-L水平，細(xì)胞截留裝置（例如，Repligen的ATF系統(tǒng)過(guò)濾模塊）通過(guò)一個(gè)使用生物反應(yīng)器包有二合一側(cè)端口。通過(guò)生物反應(yīng)器的外部環(huán)無(wú)菌連接器進(jìn)行操作。

另外，Spectrum Labs和其他公司建議一次性反應(yīng)器使用中空纖維模塊，在切向流模式下保持細(xì)胞截留。也可以使用連續(xù)離心的方式對(duì)細(xì)胞進(jìn)行截留。連續(xù)離心的優(yōu)點(diǎn)是，它避免了過(guò)濾器堵塞，并允許死細(xì)胞選擇性地分離和去除。

對(duì)于所有這些選擇，至關(guān)重要的是，保證外部循環(huán)盡可能短，以避免細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于不受控制的環(huán)境條件，最關(guān)鍵的是那些與溫度和溶解氧有關(guān)的（DO）因素。

 

灌注成功的關(guān)鍵是高效的鼓風(fēng)系統(tǒng)，這樣可以為細(xì)胞培養(yǎng)提供充足的氧氣。在增強(qiáng)的培養(yǎng)過(guò)程中，會(huì)形成大量的二氧化碳，必須去除，以防止抑制產(chǎn)物形成的或?qū)Ξa(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生的潛在的負(fù)面影響。在BIOSTAT STR一次性生物反應(yīng)器中，許多微型噴頭構(gòu)成一個(gè)大型噴霧器，通過(guò)150微米孔，壓縮空氣并對(duì)其進(jìn)行凈化。這種一次性噴射器的模塊已在傳統(tǒng)的不銹鋼反應(yīng)器應(yīng)用多年。

一個(gè)不可忽視的問(wèn)題是，由于高速氣體流量和濃縮細(xì)胞培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)含量，會(huì)導(dǎo)致廢氣排放過(guò)程中形成過(guò)多的氣溶膠。一個(gè)專門開(kāi)發(fā)的基于板式換熱器原理設(shè)計(jì)的一次性排氣冷凝器，可以減少堵塞過(guò)濾器的風(fēng)險(xiǎn)，并大大提高可靠性。賽多利斯生物反應(yīng)器額外的安全聯(lián)鎖控制軟件會(huì)防止因堵塞的細(xì)胞截留裝置而導(dǎo)致細(xì)胞溢出。此外，所有進(jìn)料泵和氣流如果超過(guò)其最大工作壓力，則將會(huì)中斷進(jìn)料。

接下來(lái)，我們將討論兩種不同的一次性2000L單抗生產(chǎn)生物反應(yīng)器。

 

美國(guó)一家大型生物技術(shù)公司評(píng)估了新系統(tǒng)在現(xiàn)有的一次性和不銹鋼生物反應(yīng)器在兩個(gè)灌注過(guò)程中的性能。這兩個(gè)過(guò)程都使用了一個(gè)普通的細(xì)胞截留裝置和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞系產(chǎn)生兩種不同的單克隆抗體。2000L是最大的反應(yīng)器。三葉片段葉輪低剪切力攪拌用于均勻混合。150um孔徑噴頭保證氧氣交換率在<40h-1。經(jīng)典的攪拌槽的設(shè)計(jì)保證了其使用符合單位體積內(nèi)功率輸入和葉尖速度等標(biāo)準(zhǔn)。幾何設(shè)計(jì)的相似性，保證了賽多利斯反應(yīng)器能從250ml無(wú)縫放大到2000L。

BIOSTAT STR生物反應(yīng)器的袋子是用新S80多層聚乙烯薄膜。生物合成也可以用該種薄膜，其將來(lái)也可用于儲(chǔ)存，凍融等方面。這將為公司減少開(kāi)支，無(wú)需購(gòu)買其他材料。在細(xì)胞培養(yǎng)中，S80薄膜提供可再生的細(xì)胞生長(zhǎng)可以媲美的硼硅酸鹽玻璃。這種生物反應(yīng)器（包括耗材）已在1000升的規(guī)模使用CHO分批單克隆抗體的生產(chǎn)過(guò)程得到證實(shí)。

為了對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行基準(zhǔn)測(cè)試，并證明其與現(xiàn)有的一次性使用生物反應(yīng)器功能的等價(jià)性，該公司使用連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)單克隆抗體A。這是一個(gè)比生產(chǎn)單克隆抗體A更苛刻的過(guò)程，因?yàn)樗�產(chǎn)生更高的細(xì)胞密度，需要更多的氧氣。這種情況對(duì)一次性生物反應(yīng)器來(lái)說(shuō)是很有挑戰(zhàn)性的，因?yàn)檫@些生物反應(yīng)器通常不能用來(lái)處理如劇烈的排氣過(guò)程。 

 

單克隆抗體-生物反應(yīng)器的功能等價(jià)性的標(biāo)桿：圖2顯示的是可行Biostat STR 2000 system的細(xì)胞密度（VCD）和細(xì)胞存活率（%）與現(xiàn)有的一次性生物反應(yīng)器的歷史數(shù)據(jù)比較。前者的平均數(shù)據(jù)屬于這些歷史數(shù)據(jù)產(chǎn)生的平均值正負(fù)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi)。

圖3（top）比較來(lái)自兩個(gè)生物反應(yīng)器的填充細(xì)胞體積數(shù)據(jù)（%）。結(jié)果表明，這兩個(gè)系統(tǒng)具有高度的相似性。圖3（bottom）packed-cell adjusted product titers顯示兩個(gè)系統(tǒng)也有很高相似性。從這些結(jié)果，我們可以得出結(jié)論，新系統(tǒng)在功能上等同于現(xiàn)有的2000-L一次性使用生物反應(yīng)器。與歷史數(shù)據(jù)相比，維持新系統(tǒng)培養(yǎng)點(diǎn)所需的氧氣較少，這表明氧傳遞能力更好。

單抗B生產(chǎn)：對(duì)BIOSTAT STR進(jìn)行一個(gè)更具挑戰(zhàn)性檢測(cè)： 兩種單抗B生產(chǎn)均在過(guò)BIOSTAT STR 2000系統(tǒng)中完成。其中一個(gè)過(guò)程比另外一個(gè)的運(yùn)行時(shí)長(zhǎng)多25%。對(duì)于較短的過(guò)程，VCD和百分之活率與現(xiàn)有的一次性使用生物反應(yīng)器的歷史數(shù)據(jù)相比較（圖4）。

Packed-cell adjusted product titer數(shù)據(jù)顯示兩者也有著很高的相似度。但是在該過(guò)程中，兩種生物反應(yīng)器存在一個(gè)明顯的差異：在新系統(tǒng)中總的氣體流量和氣裹壓力壓力通常比其他一次性使用的生物反應(yīng)器低。顯然，前者的氧傳遞效率更高。其較低的氣體流量可減少氣泡破裂引起的剪切損傷，降低因泡沫堵塞排氣過(guò)濾器的風(fēng)險(xiǎn)。這種新的生物反應(yīng)器大的頂部空間可以進(jìn)一步減輕這種風(fēng)險(xiǎn)。圖5說(shuō)明了兩種單用生物反應(yīng)器在通氣性能上的差異。上述結(jié)果表明： MAb B可以用BIOSTAT STR 2000系統(tǒng)進(jìn)行一個(gè)較長(zhǎng)時(shí)間的生產(chǎn)。

整體上來(lái)看，因?yàn)橐淮涡陨�物反�?yīng)器的氧傳遞受到限制，只有在不銹鋼生物反應(yīng)器中才有可能。

第二組培養(yǎng)過(guò)程在BIOSTAT STR 2000系統(tǒng)（具有較長(zhǎng)的不銹鋼反應(yīng)器）中進(jìn)行。圖6和圖7顯示了兩者的一致性。一次性生物反應(yīng)器提供的較低的總氣體流量足以支持細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成，顯示了系統(tǒng)的優(yōu)越氧傳遞。圖6還顯示了一次性系統(tǒng)在兩種不同攪拌速率下的性能。顯然，氧傳遞速率不一致性是該生物反應(yīng)器的限制參數(shù)，如果能解決這個(gè)問(wèn)題，則打開(kāi)了更長(zhǎng)的過(guò)程、更高的細(xì)胞密度和更高的生產(chǎn)率的大門。

我們已經(jīng)證明，BIOSTAT STR 2000系統(tǒng)在連續(xù)生產(chǎn)單克隆抗體方面，能夠提供，現(xiàn)有的一次性生物反應(yīng)器相當(dāng)?shù)男阅�。由于其�?yōu)越的氧轉(zhuǎn)移率，所以發(fā)酵過(guò)程中只需要更少的氣體。這樣就降低了生物反應(yīng)器中過(guò)多的泡沫和壓力積聚造成排氣過(guò)濾器堵塞的風(fēng)險(xiǎn)。生產(chǎn)第二種抗的過(guò)程中其要求更高，憑借其優(yōu)越的氧轉(zhuǎn)移效率，使培養(yǎng)物比其他一次性生物反應(yīng)器運(yùn)行更長(zhǎng)的時(shí)間。新系統(tǒng)的工藝性能與不銹鋼系統(tǒng)相媲美。所以BIOSTAT STR2000系統(tǒng)，生產(chǎn)單個(gè)單抗時(shí)，可以以更高的細(xì)胞密度，生產(chǎn)更多的單抗產(chǎn)品，可以的連續(xù)運(yùn)行的同時(shí)保留了一次性處理所有的優(yōu)點(diǎn)。

新興技術(shù)應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的開(kāi)發(fā)、規(guī)�；�和過(guò)程控制。一旦這些應(yīng)用與高性能、單用途的生物反應(yīng)器相結(jié)合，那么極高的細(xì)胞密度培養(yǎng)就成為了現(xiàn)實(shí)。關(guān)鍵工藝參數(shù)的控制需要先進(jìn)的過(guò)程控制軟件和適當(dāng)?shù)倪^(guò)程分析程序。氧和二氧化碳傳感器可安裝與生物反應(yīng)器排氣線路，以監(jiān)測(cè)和提供額外的觀察細(xì)胞培養(yǎng)代謝。在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，可以使用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝物如葡萄糖和乳酸的測(cè)量值來(lái)提供營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和培養(yǎng)的一般代謝狀態(tài)的信息。這些信息可以幫助公司使用全自動(dòng)控制回路確定最合適的營(yíng)養(yǎng)供給率。

自動(dòng)化可行的生物測(cè)量完全可以集成到一次性生物反應(yīng)器中，以提供獨(dú)立的生物觀測(cè)信息。線測(cè)量減少了手工取樣的必要。通過(guò)將這種傳感器安裝在生物反應(yīng)器控制系統(tǒng)中，使在連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中自動(dòng)監(jiān)測(cè)和控制成為可能。

生物反應(yīng)器和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不斷發(fā)展，使細(xì)胞密度得到提高和保持。生物制藥公司是否選擇分批補(bǔ)料工藝或開(kāi)發(fā)連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)方法將取決于它們各自的情況。技術(shù)創(chuàng)新將使他們能夠加快臨床試驗(yàn)的速度，并在預(yù)定的設(shè)計(jì)空間內(nèi)開(kāi)發(fā)出高滴度的抗體。

 

 

參考來(lái)源：

Continuous Cell Culture Operation at 2,000-L Scale by Christel Fenge, Nick Hutchinson, Michael Sherman, Vincent Lam and Melissa Carpio

 

賽多利斯斯泰帝(Sartorius Stedim Biotech)是國(guó)際領(lǐng)先的生物制藥行業(yè)設(shè)備和服務(wù)的供應(yīng)商，為全球生物制藥的開(kāi)發(fā)與生產(chǎn)提供安全、及時(shí)、經(jīng)濟(jì)的一體化解決方案。作為完整解決方案的供應(yīng)商，賽多利斯斯泰帝提供幾乎涵蓋生物制藥工藝所有步驟的產(chǎn)品組合。公司致力于推廣一次性使用技術(shù)和增值服務(wù)，滿足生物制藥行業(yè)快速發(fā)展的技術(shù)需求。公司總部位于法國(guó)歐巴涅，在巴黎的歐洲交易所上市；因其位于歐洲、北美和亞洲的生產(chǎn)與研發(fā)中心以及遍布全球的銷售網(wǎng)絡(luò)而享譽(yù)世界。

 

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