核糖體是細胞內(nèi)最重要的細胞器之一。在生物體中DNA所包含的遺傳信息翻譯為蛋白質(zhì) 的過程包括：首先DNA被轉(zhuǎn)錄為mRNA，而核糖體結(jié)合在mRNA上合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)。真核 生物中核糖體的合成從核仁中開始，進一步在核仁和核質(zhì)中加工成熟直至它們被運輸進入胞 質(zhì)。這個過程涉及上百種核糖體生物合成因子，Rea1 AAA-ATP酶是核糖體生物合成中典型 的ATP酶。Rea1蛋白通過自身的6×ATP酶環(huán)狀結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的機械力通過MIDAS和能與 MIDAS相互作用的結(jié)構(gòu)域?qū)⒑巳手?0S前體上的Ytm1因子和核質(zhì)中60S前體上的Rsa4因子 解離下來從而使核糖體60S大亞基能被運送入胞質(zhì)。

在我們的研究中發(fā)現(xiàn)dek*是全新的玉米dek突變體。突變體呈現(xiàn)小而凹陷的籽粒表型， 并伴隨胚、胚乳、幼苗的發(fā)育滯后。通過對dek*的圖位克隆，發(fā)現(xiàn)dek*突變基因編碼玉米中 的Rea1蛋白，通過等位測試我們確定了這一結(jié)果。測序結(jié)果表明突變本質(zhì)是編碼區(qū)的第 2359 個密碼子處發(fā)生單堿基突變導(dǎo)致所編碼氨基酸由丙氨酸（ GCG ）變?yōu)槔i氨酸 （GTC）。該點突變導(dǎo)致了ZmRea1功能的減弱。而ZmRea1功能的減弱一定程度上抑制了核糖體大亞基的成熟及出核。我們的研究還表明dek*影響了不同mRNA的轉(zhuǎn)錄及翻譯調(diào)控，同時影響了基礎(chǔ)翻譯效率和細胞周期進程。


1. dek*是缺陷型籽粒突變體產(chǎn)生小而凹陷的籽粒，并伴隨發(fā)育滯后

授粉后15天的純合突變體籽粒呈現(xiàn)出小且扁的表型，而成熟的純合突變體籽粒由于周邊 野生型籽粒的擠壓變的小、凹陷和皺縮。百粒重發(fā)現(xiàn)dek*突變體籽粒相對于野生型顯著下降 39.85%。石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)胚的縱向切片顯示了胚芽以及胚根的發(fā)育相比較于野生型滯后 三天以上。野生型和突變體植株苗期都能生長正常。發(fā)芽后4天和7天幼苗突變體發(fā)育顯著滯 后于野生型。


2. Rea1的圖位克隆及等位測試

dek*基因被定位在第六號染色體大約101.6kb范圍內(nèi)。在候選基因1中只有一個單個的核苷酸多態(tài)導(dǎo)致一個氨基酸的改變。等位測試確認了ZeRea1就是dek*基因。定量PCR與 Western雜交實驗確認了ZeRea1在突變體籽粒中表達量的下降。


3. Rea1蛋白在不同物種中高度保守且組成型表達

進化樹的分析結(jié)果顯示玉米中Rea1蛋白與其它植物中該蛋白是高度保守的，與酵母、 哺乳動物和微生物中該蛋白也有一定的保守性。定量RT-PCR分析揭示了ZmRea1在玉米的 各個組織中廣泛表達，包括花絲、雄穗、果穗、根、包衣、莖、葉以及籽粒。將總的核蛋白 及胞質(zhì)蛋白分離后用Rea1多克隆抗體對這兩個組分進行點雜，來檢測Rea1蛋白的分布。結(jié) 果顯示Rea1只在核蛋白組分中，表明Rea1定位在細胞核中。


4. rea1突變體影響了60S大亞基的成熟及出核

蔗糖密度梯度離心分析了突變體和野生型籽粒核糖體的分布情況。分析結(jié)果顯示和40S 核糖體亞基相比，突變體的60S核糖體亞基相較于野生型顯著下降。免疫雜交顯示，突變體 和野生型籽粒在核蛋白和胞質(zhì)蛋白中幾乎無差別。

透射電鏡發(fā)現(xiàn)突變體胞質(zhì)中60S核糖體大亞基的減少。突變體中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上以及蛋白 體周圍的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體數(shù)量相較于野生型有顯著下降。這些結(jié)果都一致表明突變體 中60S大亞基出核受到影響，且為特異性影響60S大亞基的成熟及輸出路徑而對40S小亞基 的成熟未造成影響。

5. rea1基因影響核糖體合成、翻譯延伸及細胞周期相關(guān)基因的表達

RNA-seq轉(zhuǎn)錄組分析篩選出的差異基因共有2076個。在這2076個基因中GO路徑分析顯 示有功能注解的828個差異表達基因主要與3個GO terms相關(guān)GO: 0005840 (核糖體, p- value=2.34E-130), GO: 0006414 (翻譯延伸, p-value=2.30E-17) 和GO: 0000786 (核仁, p-value= 8.22E-29)。      

為了進一步證實通過RNA-seq觀察到的突變體和野生型胚乳差異表達基因，我們從每個 分類中挑選了最顯著的差異表達基因進行定量RT-PCR，結(jié)果顯示出與RNA-seq相似程度的 mRNA積累差異。

6. rea1中不同mRNA的翻譯調(diào)控

mRNA多聚核糖體化的水平和其翻譯水平是極其一致的。為了檢測突變體對mRNA翻譯 調(diào)控的影響，我們?nèi)�面評估了15DAP突變體和野生型籽粒中核糖體復(fù)合體中所結(jié)合的轉(zhuǎn)錄 本總量與所有基因轉(zhuǎn)錄本總量的對比情況。突變體和野生型15DAP玉米籽粒中多聚核糖體 結(jié)合的RNA和總RNA的比值分別為36.41% 和25.57%，突變體比野生型提高了1.42倍，這 個結(jié)果與通過A254吸收峰分析的多聚核糖體復(fù)合物與總核糖體的比值結(jié)果一致。

7. rea1影響胚乳內(nèi)擴增的細胞周期

流式細胞分析授粉后15天突變體和野生型玉米籽粒胚乳細胞，結(jié)果顯示突變體中倍型大 于等于12C占總比例的18.08%，而野生型的占比為26.18%。在授粉后18天的玉米籽粒胚乳 細胞中突變體細胞核倍型大于等于12C占總比例的19.25%而野生型為24.22%。這些結(jié)果表 明dek*突變體中胚乳細胞內(nèi)擴增的細胞周期進程受到影響最終導(dǎo)致籽粒的發(fā)育滯后。

該研究中，ZmRea1轉(zhuǎn)錄組RNA-seq服務(wù)由上海伯豪生物技術(shù)有限公司提供。

原文出處：W Qi, J Zhu, Q Wu, Q Wang , X Li , D Yao , Y Jin , G Wang , G Wang , and R Song Maize rea1 mutant stimulates ribosome use efficiency and triggers distinct transcriptional and translational responses Plant Physiology 2015 (published online)